[發明專利]用于檢測轉基因大豆的引物和探針組合、檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201610834257.6
• 申請日: 2016-09-20
• 公開（公告）號: CN107868838A
• 公開（公告）日: 2018-04-03
• 發明（設計）人: 趙暉;乾義柯;魏霜;鄭劍
• 申請（專利權）人: 湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理事務所(普通合伙)11457
• 代理人: 黃云鐸

1.引物對和探針組合，其特征在于，所述引物對和探針組合包括第一組引物對、第二組引物對、第一探針和第二探針，所述第一組引物對包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第一探針與所述第一組引物對相對應，所述第一探針包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；所述第二組引物對包含SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，所述第二探針與所述第二組引物對相對應，所述第二探針包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的引物對和探針組合在檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因，或制備檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的產品中的應用。

3.一種用于對轉基因大豆進行檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物對和探針組合。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：

熒光定量PCR擴增試劑，所述熒光定量PCR擴增試劑包括dNTPs、Mg²⁺、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合酶，所述dNTPs、Mg²⁺、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合酶均來源于Takara公司的貨號為RR390A的試劑盒中所包含的試劑；

所述試劑盒還包括DNA提取試劑，所述DNA提取試劑包括來自達安基因的貨號為DA-Z146的核酸提取試劑、Promega公司的貨號為A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的貨號為9781的MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit中所包含的試劑；

所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。

5.權利要求3或4所述的試劑盒在檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因，或制備檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的產品中的應用。

6.一種檢測或輔助檢測轉基因大豆DAS81419和大豆內源基因的雙重熒光PCR方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1)雙重熒光PCR擴增

以生物樣品含有的DNA為模板利用權利要求1所述的引物對和探針組合或權利要求3-4中任一項所述試劑盒進行雙重熒光PCR擴增；

2)根據雙重熒光PCR擴增的結果判斷生物樣品是否為轉基因大豆DAS81419，同時判斷樣品是否含有大豆成分，或生物樣品是否含有轉基因大豆DAS81419和/或大豆成分的品系特異性基因成分。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，在步驟1)之前還包括在生物樣品中提取DNA的步驟；

所述在生物樣品中提取DNA是采用達安基因的貨號為DA-Z146的核酸提取試劑盒、Promega公司的貨號為A1120的Wizard Genomic DNA purification kit或TaKaRa公司的貨號為9781的MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit進行的。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述雙重熒光PCR擴增的反應體系如下：

所述Probes Master 2×conc來源于Takara公司的貨號為RR390A的試劑盒。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：所述雙重熒光PCR擴增的反應體系如下：所述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5中所示引物的用量均為0.5μL，所述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6中所示探針的用量分別為0.2μL和0.1μL；

所述雙重熒光PCR擴增反應條件：95℃3min；95℃、5～10s，60℃、25～60s，40循環。