[發(fā)明專利]一種快速高效同時檢測土壤、污泥中11種抗生素含量的方法

有效

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• 申請日: 2016-09-19
• 公開（公告）號: CN106468691B
• 公開（公告）日: 2019-03-08
• 發(fā)明（設計）人: 南瓊;唐景春;彭中亞;黃華;黃耀
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/08;G01N30/72
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1.一種快速高效同時檢測土壤、污泥中11種抗生素含量的方法，其特征在于，包含以下步驟：

（1）土壤、污泥樣品的采集、保存與前期處理

采集0~20cm表層土壤在-20℃條件下避光保存，對于底泥，采集保存時注意趕出空氣，使用冷凍干燥機冷干，研磨過40目篩子，-20℃冷藏；

（2）配制土壤、污泥抗生素提取液

稱取含有兩個結晶水的磷酸二氫鈉3.12g，加入200μL濃磷酸，用超純水定容至100ml，得到pH=3的磷酸緩沖溶液；將色譜級乙腈與磷酸緩沖溶液按照體積比7：3混合，得到土壤、污泥提取液;

（3）提取土壤、污泥中抗生素

稱取土壤或污泥樣品1g，精確到0.0001g，于50ml離心管中，依次加入0.2gNa₂EDTA和10mL土壤、污泥抗生素提取液，渦旋1分鐘，超聲10分鐘，離心,8000轉,15分鐘，收集上清液，此過程共重復3次，將得到的上清液合并后，用超純水稀釋至400ml，使用0.45μm有機相微孔濾膜抽濾，

（4）固相萃取富集并濃縮抗生素

使用SAX和HLB小柱進行固相萃取：將SAX柱和HLB柱通過SPE連接柱小件連接起來置于固相萃取真空裝置上，依次使用6ml色譜級甲醇和6mL超純水對小柱進行活化和沖洗，隨后，使用大容量采樣管將抗生素提取液與固相萃取柱連接，打開真空泵進行固相萃取，結束后，用超純水清洗固相萃取小柱，真空干燥30分鐘，棄去SAX小柱，使用2×5mL色譜級甲醇將抗生素從HLB小柱中洗脫于15mL試管中，50℃水浴條件下高純氮氣吹至近干，添加1mL色譜級甲醇再次溶解抗生素后，使用0.22μm針式濾膜轉移至2mL進樣小瓶中，上機測定，

（5）UPLC/MS/MS檢測

將待測提取液通過UPLC/MS/MS進行分析檢測，測定的色譜條件為：采用BEH-C₁₈色譜柱，2.1×100mm，二元梯度泵；MS/MS檢測器；流動相A為0.5%的甲酸，流動相B為乙腈；進樣體積10μL；流速0.4mL/min；柱溫50℃；梯度洗脫順序：0~1.5min，90%~84%A；1.5~2min，84%~82%A；2~2.5min，82%~80%A；2.5~3min，80%~78%A；3~4min，78%~65%A；4~4.5min，65%~40%A；4.5~5min，40%A；5~6.5min，40%~5%A；6.5~7min，5%~90%A；7~10min，90%A;

質譜條件為：氯霉素采用負離子模式，錐孔電壓34V，碰撞電壓16V，定性判定母離子質荷比為321.00，子離子質荷比為151.97；氟苯尼考采用負離子模式，錐孔電壓16V，碰撞電壓18/8V，定性判定母離子質荷比為356.03，子離子質荷比為185.05/336.00；呋喃唑酮采用正離子模式，錐孔電壓46V，碰撞電壓20/22V，定性判定母離子質荷比為226.07，子離子質荷比為67.08/122.06；恩諾沙星采用正離子模式，錐孔電壓10V，碰撞電壓24V，定性判定母離子質荷比為360.2603，子離子質荷比為342.2815；氧氟沙星采用正離子模式，錐孔電壓為12V，碰撞電壓為30V，定性判定母離子質荷比為362.2395，定性判定子離子質荷比為261.2175/318.2567；土霉素采用正離子模式，錐孔電壓為10V，碰撞電壓為26V，定性判定母離子質荷比為461.2439，定性判定子離子質荷比為426.2635；紅霉素采用正離子模式，錐孔電壓為6V，碰撞電壓為34/34V，定性判定母離子質荷比為734.4931，定性判定子離子質荷比為158.1931/576.5374；磺胺嘧啶采用正離子模式，錐孔電壓為6V，碰撞電壓為24V，定性判定母離子質荷比為251.1482，定性判定子離子質荷比為156.0689；磺胺甲惡唑采用正離子模式，錐孔電壓為4V，碰撞電壓為24V，定性判定母離子質荷比為254.148，定性判定子離子質荷比為156.0694；氨芐青霉素采用正離子模式，錐孔電壓為32V，碰撞電壓為16/16V，定性判定母離子質荷比為350.08，定性判定子離子質荷比為106.1/174.06；四環(huán)素采用正離子模式，錐孔電壓為4V，碰撞電壓為24/22V，定性判定母離子質荷比為445.249，定性判定子離子質荷比為154.1075/410.1938，

（6）計算分離出的抗生素對應的峰面積，根據標準曲線進行定量計算，得出抗生素含量。