[發明專利]抗體調控的雙抗原特異性T細胞及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201610824893.0
• 申請日: 2016-09-14
• 公開（公告）號: CN106635998B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 深圳市默賽爾生物醫學科技發展有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K39/395;A61K47/46;A61P35/00
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所44237
• 代理人: 左光明

1.一種雙抗原特異性T細胞，所述雙抗原特異性T細胞對TNBC細胞的特異性識別與殺傷，包括間皮素抗原特異性T細胞受體基因和在HIF-1α抗體介導下特異性識別HIF-1α抗原的抗體Fc段特異性T細胞受體基因。

2.根據權利要求1所述的雙抗原特異性T細胞，其特征在于：所述間皮素抗原特異性T細胞受體基因設于Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段中，所述Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段獲得方法包括如下步驟：

獲取Meso抗原免疫總cDNA；

將所述Meso抗原免疫總cDNA與Meso抗體重鏈可變區VH引物和輕鏈可變區VL引物進行PCR，獲得Meso VH和Meso VL基因片段；

將所述Meso VH與Meso VL基因片段采用連接肽連接，獲得Meso抗體scFv基因片段；

將所述Meso抗體scFv基因片段與pcDNA載體連接，獲得pcDNA-Meso/sc Fv質粒；

將人CD8分子基因片段和CD3ζ鏈胞內段克隆進所述pcDNA-Meso/sc Fv質粒，獲得pcDNA-Meso/scFv-CD8-CD3ζ質粒，酶切后獲得Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段。

3.根據權利要求1所述的雙抗原特異性T細胞，其特征在于：所述抗體Fc段特異性T細胞受體基因設于CD16–CD28-TCRζ基因片段中，所述CD16–CD28-TCRζ基因片段獲得方法包括如下步驟：

將人CD16分子基因片段與pcDNA載體連接，獲得pcDNA-CD16質粒；

將CD28分子胞內結構域克隆進所述pcDNA-CD16質粒，獲得pcDNA-CD16-CD28質粒；

將CD28核苷酸336-660區域和TCRζ胞內結構域PCR合并成基因片段后克隆進所述pcDNA-CD16-CD28質粒，酶切后獲得CD16-CD28-TCRζ基因片段。

4.根據權利要求1-3任一所述的雙抗原特異性T細胞制備方法，包括如下步驟：

將T細胞被第一慢病毒和第二慢病毒同時感染；所述第一慢病毒含有所述間皮素抗原特異性T細胞受體基因，所述第二慢病毒含有所述抗體Fc段特異性T細胞受體基因。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：所述第一慢病毒按照如下方法制備獲得：

將Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段與入門載體混合，以使所述Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段嵌入所述入門載體，而獲得帶有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入門載體；以及

將所述帶有Meso/scFv-CD8-CD3ζ基因片段的入門載體與慢病毒質粒混合重組，以建立間皮素抗原特異性T細胞受體表達質粒；

將所述間皮素抗原特異性T細胞受體表達質粒與病毒包裝質粒共轉染293T細胞，獲得第一慢病毒。

6.根據權利要求4-5任一所述的制備方法，其特征在于：所述第二慢病毒按照如下方法制備獲得：

將CD16–CD28-TCRζ基因片段與入門載體混合，以使所述CD16–CD28-TCRζ基因片段嵌入所述入門載體，而獲得帶有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入門載體；以及

將所述帶有CD16–CD28-TCRζ基因片段的入門載體與慢病毒質粒混合重組，以建立CD16–CD28-TCRζ慢病毒表達質粒；

將所述CD16–CD28-TCRζ慢病毒表達質粒與病毒包裝質粒、共轉染293T細胞，獲得第二慢病毒。

7.一種靶向三陰性乳腺癌細胞的藥物制劑，包括權利要求1-3任一所述的雙抗原特異性T細胞或者由權利要求4-6任一所述的制備方法制備的雙抗原特異性T細胞，還包括HIF-1α抗體。

8.根據權利要求7所述的藥物制劑，其特征在于：所述雙抗原特異性T細胞與HIF-1α抗體之間的含量比為(10⁴-10⁶個細胞)：(0.5-5μg)。