[發明專利]一種花椰菜花球花梗長度的分子標記輔助選擇方法

有效

• 申請號: 201610824333.5
• 申請日: 2016-09-14
• 公開（公告）號: CN106399498B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 趙振卿;顧宏輝;盛小光;虞慧芳;王建升
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王靜

本發明屬于蔬菜分子育種技術領域，尤其涉及利用分子標記對花椰菜花梗長度性狀進行輔助選擇的方法。一種花椰菜花球花梗長度的分子標記輔助選擇方法，該方法包括：（1）待檢測材料準備；（2）待檢測樣品基因組DNA的PCR擴增；（3）PCR產物的酶切反應及電泳檢測；（4）待檢測樣品花球花梗長度的鑒定與篩選。本發明為長花?；ㄒ似贩N選育提供了簡便、高效、穩定的輔助選擇方法。

技術領域

本發明屬于蔬菜分子育種技術領域，尤其涉及利用分子標記對花椰菜花梗長度性狀進行輔助選擇的方法。

背景技術

松散花球型花椰菜（簡稱松花菜）是近年來迅速發展起來的一種花椰菜新類型，由于其口感脆嫩、易入味等優點，廣受我國消費者青睞。據不完全統計，目前松花菜在我國的栽培面積與普通花椰菜相當，約在300萬畝左右。松花菜與普通花椰菜最顯著的差異在于其松大的花球，而花球花梗長度則是花球松大的重要因素（附圖1）。因此，花球花梗長度是松花菜商品性的決定因素之一，其遺傳改良是花椰菜遺傳育種的重要課題之一。

目前，花椰菜花梗長度的遺傳改良主要通過表型選擇來完成，該方法必須在花椰菜花球成熟期才能完成，需要耗費大量時間（從播種至選擇完成一般需要3-5個月）、土地及人力資源，難以開展大規模的材料鑒定和篩選。而分子標記輔助選擇技術則可以通過對育種材料目標性狀相關聯的DNA序列的鑒定來完成針對目標性狀表型的篩選。這使得育種材料的選擇在苗期甚至種子時期即可開展，大大提高了選擇效率。此外，分子標記輔助選擇技術不受外界環境的影響，結果更加穩定可靠。目前，分子標記在水稻、玉米、番茄等糧食和蔬菜作物中已得到廣泛的應用，極大程度上推動了這些農作物遺傳育種的發展。其中，單核苷酸多態性（SNP）由于變異豐富、易于實現自動化和高通量等優勢，是最具發展前景的分子標記類型之一。然而，由于花椰菜分子生物學研究的相對滯后性，分子標記尤其是基于SNP的標記輔助選擇在花椰菜育種中極少有實質性的應用。因此，開發實用性強、準確性高、成本低的與花椰菜花球花梗長度連鎖的分子標記，可以顯著提高花球花梗長度選擇的效率和準確性，在花椰菜遺傳育種中極具應用價值。

發明內容

本發明的第一個目的是：針對花椰菜傳統育種中的花球花梗長度選擇完全依賴于表型調查，需耗費大量時間、土地資源的現狀，開發一種快捷、高效、穩定、準確的分子標記輔助選擇花椰菜花球花梗長度的方法。本發明第二個目的是提一種檢測松花菜花球花梗長度的特異引物組合。

本發明的第一個目的是通過以下技術方案得以實現的：

一種松花菜花球花梗長度的分子標記輔助選擇方法，該方法按如下步驟進行：

1）待檢測材料準備：將待檢測的花椰菜材料按照常規方法播種、育苗，并分單株編號；于2-3片真葉期取各單株葉片按照常規CTAB方法分別提取基因組DNA，-20℃保存，備用；

2）待檢測樣品基因組DNA的PCR擴增：利用特異引物組合對待檢測樣品的基因組DNA分別進行PCR擴增，特異引物組合中上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCAAATCTTTT -3’；反應總體積20μL，具體體系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl₂，1×擴增緩沖液，基因組DNA 50ng，加dd H₂O至20μL；熱循環程序為：94℃預變性2 min，1個循環；94℃變性1min，55℃復性30 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸10min；4℃保存；

3）PCR產物的酶切反應及電泳檢測：將2）中的PCR產物利用限制性內切酶Mae I在37℃條件下酶切3 h，酶切體系含 PCR 產物 7μL， 10×buffer 1μL，1 U Mae I，加dd H₂O至10μL；酶切后將其產物在1.2% 瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，溴乙錠顯色；