[發明專利]一種病毒侵染性克隆的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201610824257.8
• 申請日: 2016-09-14
• 公開（公告）號: CN106399356B
• 公開（公告）日: 2019-09-24
• 發明（設計）人: 言普;庹德財;付蘭蘭;沈文濤;周鵬
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;陳歡

本發明提供一種病毒侵染性克隆的構建方法及其應用。本發明提供方法包括如下步驟：整個或分段擴增病毒基因組，表達載體線性化處理，基因組兩端或各基因片段與表達載體兩端分別設計有用于體外拼接的重疊序列；病毒基因組或各基因片段與線性化表達載體進行體外拼接；拼接產物直接轉化農桿菌，獲得含有病毒侵染性克隆的重組農桿菌。重組農桿菌用于接種，獲得病毒的系統性侵染。本發明的創新點在于將病毒基因組與表達載體通過體外核酸拼接后，不轉化大腸桿菌，而是轉化農桿菌，獲得在農桿菌中穩定的病毒侵染性克隆，避免了病毒在大腸桿菌中產生的毒性或不穩定現象，構建方法更為靈活和簡便。

技術領域

本發明涉及病毒學和分子生物學領域。具體地，本發明涉及一種病毒侵染性克隆的構建方法及其應用。

背景技術

侵染性克隆是病毒學研究領域的基礎研究工具。克隆后的病毒基因組易于分子操作，因此，侵染性克隆在研究病毒的基因功能、侵染機理、病毒-宿主互作等方面具有重要作用。并且，病毒的侵染性克隆也可用作基因表達或沉默的載體。

申請號201410706857.5(黃瓜綠斑駁花葉病毒的侵染性克隆載體和農桿菌菌株及其制備方法和應用)公開了一種黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)的侵染性克隆的構建方法，該病毒侵染性克隆由CGMMV全序列融合到帶35S啟動子和核酶的載體pCB301-CH后，將重組載體pCB301-CH轉入大腸桿菌，挑選具有全長插入的克隆導入導入到農桿菌菌株EHA105獲得病毒侵染性克隆。

然而，上述專利及其類似技術方案在病毒侵染性克隆構建過程中存在的一個重要問題是，很多病毒在大腸桿菌中不穩定。由于很多病毒同時具有原核和真核表達的能力，它們在大腸桿菌中的表達產物會影響大腸桿菌的生長。因此，在構建病毒的侵染性克隆中經常會出現含病毒基因組的載體轉化大腸桿菌后無法獲得克隆菌落，或是獲得的克隆菌落發生基因突變(堿基突變、片段缺失)的問題，給病毒侵染性克隆的構建帶來了很大的障礙。例如馬鈴薯Y病毒屬的番木瓜環斑病毒和番木瓜畸形花葉病毒，我們多次嘗試將它們的基因組導入大腸桿菌，但無法獲得序列正確的克隆。

為解決這一障礙，目前有降低大腸桿菌培養溫度、嘗試不同大腸桿菌菌株、在病毒基因組插入內含子等方法。前兩個方法存在效果不普遍或效果不明顯的問題，而插入內含子的方法雖然能有效解決病毒毒性蛋白在大腸桿菌中表達的問題，但插入內含子數量及位置的確定需要大量的前期工作或摸索。

因此，現有技術對于未能提供一種簡單有效的、解決在大腸桿菌中不穩定的侵染性病毒克隆的方法。

發明內容

針對侵染性病毒克隆構建過程中存在的問題，本發明第一方面提供病毒侵染性克隆的構建方法，包括：將具有病毒基因組的載體轉化農桿菌，獲得含有病毒侵染性克隆的重組農桿菌，其中，所述具有病毒基因組的載體為采用體外克隆法或體外基因拼接法制備的插入或拼接有病毒基因組的載體。

在本發明一個可選的實施例中，所述采用體外克隆或基因拼接法制備的插入或拼接有病毒基因組的載體的步驟包括：

1)通過PCR整體或分段(優選為分2-5段)擴增病毒基因組；所得基因組兩端或各基因片段兩端設計有用于體外拼接反應的15-30bp重疊的接頭序列；

2)(通過PCR擴增、酶切等方法)獲得線性化表達載體；所得線性化的表達載體兩端設計有用于體外拼接反應的重疊序列；

3)通過Gibson拼接或In-Fusion拼接等常規體外接方法使病毒基因組與線性化表達載體進行體外拼接，獲得插入或拼接有病毒基因組的載體。

在本發明一個可選的實施例中，本發明第一方面提供一種簡單有效的病毒侵染性克隆構建方法具體包括如下步驟：