[發(fā)明專利]雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體、其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610821379.1
• 申請日: 2016-08-29
• 公開（公告）號: CN106399374B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫殿興;李保勝;孫爍;李敏然;程欣
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/66;C12N15/867;C12N15/861;C12N15/864
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務(wù)所(普通合伙) 13113
• 代理人: 張紅衛(wèi)

本發(fā)明提供了一種雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體、其制備方法及應(yīng)用，以表達(dá)野生型HBV的質(zhì)粒pCH?9/3093為載體進(jìn)行基因修飾，構(gòu)建HBV?shRNA雙表達(dá)載體：首先，通過點(diǎn)突變，在基因組各蛋白起始密碼ATG后添加終止密碼；其次，將C基因區(qū)的203?407位和S基因區(qū)的1715?1961位的序列刪除；最后，再在兩個基因區(qū)分別插入H1?shRNA表達(dá)框和U6?shRNA表達(dá)框，構(gòu)建雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體；本發(fā)明構(gòu)建的雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH?203H1shG?1715U6shG，抑制hrGFP的表達(dá)；構(gòu)建的雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH?203H1sh6?1715U6sh8，抑制HBV的表達(dá)與復(fù)制。本發(fā)明適用于雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體及其制備。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種乙型肝炎病毒載體，具體涉及一種雙表達(dá)小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

乙型肝炎病毒(HBV)是一種以逆轉(zhuǎn)錄方式復(fù)制的DNA病毒，其基因組結(jié)構(gòu)緊湊，長度只有3.2kb。據(jù)WHO估計，全球有2.4億人慢性感染HBV，HBV是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌等終末肝病的主要致病因素。當(dāng)前正式批準(zhǔn)用于臨床的藥物包括干擾素(IFN)和核苷(酸)類似物(NAs)，但I(xiàn)FN治療常常受限于藥物不良反應(yīng)，NAs類藥物往往需要患者終生服藥，這是由于宿主細(xì)胞核內(nèi)持續(xù)存在共價閉合環(huán)狀(ccc)DNA。以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前基因組RNA(pgRNA)以及幾種亞基因組RNA，NAs可以有效的抑制pgRNA的逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制，進(jìn)而阻斷新病毒的產(chǎn)生，但并不能影響亞基因組RNA產(chǎn)生多種病毒抗原，而研究發(fā)現(xiàn)大量產(chǎn)生的病毒抗原會影響獲得性免疫應(yīng)答，因此不能減少病毒抗原成為NAs治療的一個缺憾。

RNA干擾(RNAi)是一種強(qiáng)有力的基因沉默技術(shù)，能夠抑制許多種病毒的復(fù)制。RNAi對HBV復(fù)制及基因表達(dá)的抑制效應(yīng)尤其明顯，因為HBV的復(fù)制直接依賴于pgRNA，而且HBV的多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物共用3’端的重疊序列，所以只需一個RNAi效應(yīng)子就可以靶向抑制病毒的多條RNA。然而，抗HBV的RNAi療法走向臨床還面臨諸多嚴(yán)重的挑戰(zhàn)，其中包括脫靶效應(yīng)和刺激產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)，盡管近年在siRNA非病毒載體的化學(xué)穩(wěn)定性和遞送的器官靶向性方面取得了長足的進(jìn)步，但在徹底清除cccDNA池或者說達(dá)到免疫控制之前，合成的siRNA仍需要多次重復(fù)給藥。載體表達(dá)的短發(fā)夾RNA(shRNA)也面臨如何靶向性遞送到肝臟并且到達(dá)所有肝細(xì)胞的問題，采用病毒載體可以實(shí)現(xiàn)高效的遞送，例如腺病毒(Ad)、腺相關(guān)病毒(AAV)以及慢病毒，然而，非整合病毒載體只能短暫的表達(dá)shRNA，也需要重復(fù)給藥，這可能要受到抗病毒免疫應(yīng)答的影響，對于整合病毒載體來說，則有插入突變、異常拼接等危險。

如果把HBV作為遞送shRNA的載體，以一種在特定條件下才具有復(fù)制能力的工作方式，則有希望克服前述大部分的難題。像自發(fā)產(chǎn)生的復(fù)制缺損型HBV病毒顆粒一樣，HBV載體作為真正的HBV具有肝組織靶向性，經(jīng)過設(shè)計，在居住病毒反式互補(bǔ)作用下可以產(chǎn)生新的載體顆粒并播散，并且當(dāng)野生型(wild-type，wt)HBV消失后載體的播散即停止。但將HBV改造為載體要克服幾個重要的難題，首先是HBV的基因組結(jié)構(gòu)非常緊湊，每一個核苷酸都是某個開放讀碼框(open reading frame，ORF)的編碼核苷酸，并且超過半數(shù)的核苷酸處于兩個ORF內(nèi)；而且，所有的調(diào)節(jié)原件諸如啟動子、增強(qiáng)子以及眾多的復(fù)制順式作用元件，都與ORF重疊，因此，即使是所需的反式互補(bǔ)因子全部存在的情況下，不恰當(dāng)?shù)幕蛐蛄芯庉嬕埠苋菀讓?dǎo)致載體的復(fù)制能力受損。第二，所遞送的shRNA必須有效地靶向HBV，而且shRNA能達(dá)到產(chǎn)生設(shè)計沉默效應(yīng)水平所需要的數(shù)量，還要把脫靶效應(yīng)降至最小。第三，載體產(chǎn)生的shRNA不能靶向載體自身。至少，用HBV載體重復(fù)感染已經(jīng)感染HBV的細(xì)胞看上去無效，但在NAs治療時，野生型HBV最終被耐NA變異病毒取代，這種現(xiàn)象顯示重復(fù)感染的確發(fā)生了，而且，在土撥鼠肝炎病毒模型中直接顯示了重復(fù)感染的現(xiàn)象。

因此，研究一種HBV-shRNA雙表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，具有重要的意義。