[發(fā)明專利]雙表達小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體、其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610821379.1
• 申請日: 2016-08-29
• 公開（公告）號: CN106399374B
• 公開（公告）日: 2019-07-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫殿興;李保勝;孫爍;李敏然;程欣
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/66;C12N15/867;C12N15/861;C12N15/864
• 代理公司: 石家莊科誠專利事務(wù)所(普通合伙) 13113
• 代理人: 張紅衛(wèi)

1.一種雙表達小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體，其特征在于：以表達野生型HBV的質(zhì)粒pCH-9/3093為載體進行基因修飾，構(gòu)建HBV-shRNA雙表達載體：首先，通過點突變，在基因組各蛋白起始密碼ATG后添加終止密碼；其次，將C基因區(qū)的203-407位和S基因區(qū)的1715-1961位的序列刪除；最后，在C基因區(qū)的203-407位之間插入H1-shRNA表達框；在S基因區(qū)的1715-1961位之間插入U6-shRNA表達框，構(gòu)建雙表達小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體，

其中，所述的H1-shRNA表達框包括H1啟動子、shRNA序列和終止信號T6；

所述的U6-shRNA表達框包括U6啟動子、shRNA序列和終止信號T6；

所述的H1-shRNA表達框中的shRNA序列為靶向S基因區(qū)內(nèi)的1698-1716位的sh6，

所述的U6-shRNA表達框中的shRNA序列為靶向S基因區(qū)內(nèi)的1953-1971位的sh8；

所述的H1啟動子和U6啟動子的長度分別為103和122bp；

所述點突變的突變點包括：核心區(qū)-G28T、聚合酶區(qū)-T444A、 preS1區(qū)-C954T、preS2區(qū)-C1275T、S區(qū)-C1482T以及X區(qū)-C2677T。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙表達小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體，其特征在于：所述的sh6和sh8為除了HBx mRNA以外的所有HBV RNA。

3.一種制備如權(quán)利要求1-2中任一項所述的雙表達小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體的方法，其特征在于它按照以下步驟順序進行：

1)在pCH-9/3093質(zhì)粒上引入突變點，以終止各基因翻譯蛋白質(zhì)，形成質(zhì)粒pCH-9/3093M6；

2)在HBV核心蛋白區(qū)插入含有H1啟動子的序列，構(gòu)建質(zhì)粒pCH-M6-203H1；

3)構(gòu)建在核心蛋白區(qū)表達H1-sh6的載體pCH-M6-203H1sh6；

4)在S區(qū)插入U6-shRNA表達盒，構(gòu)建在S區(qū)表達U6-sh8的載體pCH-M6-1715U6sh8；

5)構(gòu)建雙表達小干擾RNA的復(fù)制缺損型乙型肝炎病毒載體pCH-203H1sh6-1715U6sh8，抑制HBV的表達與復(fù)制。