[發(fā)明專利]一株產(chǎn)二甲苯單加氧酶的菌株Arthrobacterwoluwensis及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610814722.X
• 申請日: 2016-09-12
• 公開（公告）號: CN106434434B
• 公開（公告）日: 2017-12-22
• 發(fā)明（設計）人: 李廣生;楊濤;萬剛強;曲欣欣
• 申請（專利權(quán)）人: 迪沙藥業(yè)集團有限公司;威海迪素制藥有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P17/12;C12R1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領域，特別涉及一株產(chǎn)二甲苯單加氧酶菌株 (Arthrobacter woluwensis) HW-1，及其在微生物發(fā)酵法制備 5-甲基吡嗪-2-羧酸中的應用。

背景技術(shù)

5-甲基吡嗪-2-羧酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid）是一種米白色固體結(jié)晶，Cas號為5521-55-1，分子式為C₆H₆N₂O₂，分子量138.12，熔點166～169℃，具有刺激性氣味，暴露在空氣中會緩慢氧化，由棕色油狀物變?yōu)樽睾谏吵頎罟腆w，需真空密封保存。

5-甲基吡嗪-2-羧酸結(jié)構(gòu)式

5-甲基吡嗪-2-羧酸在醫(yī)藥工業(yè)領域有著廣泛的用途，主要用于合成降血糖藥物格列吡嗪、新型抗高血壓藥物阿西莫司以及抗結(jié)核藥物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等，因此對制備5-甲基吡嗪-2-羧酸的研究具有重要的實際應用價值。

5-甲基吡嗪-2-羧酸的化學合成主要有以下工藝（陳炳和等, 化學試劑, 2008, 30(11)：869-870; 董陽陽等, 化學試劑, 2013, 35(6):505～509)：

.以丙酮醛和二氨基馬來腈為原料催化環(huán)合生成2,3-二氰基-5-甲基吡嗪，然后再以環(huán)合生成的2,3-二氰基-5-甲基吡嗪酸化水解制得吡嗪二羧酸，最后經(jīng)過脫羧得到目標產(chǎn)物5-甲基吡嗪-2-羧酸。由于二氨基馬來腈合成條件苛刻，進口價格昂貴，且有劇毒，該方法生產(chǎn)成本較高。

.氯化?；庋趸?步法：用2,5-二甲基吡嗪為原料在過氧苯甲酰引發(fā)下與N-氯代丁二酰亞胺氯化得2-甲基-5-氯甲基吡嗪，再經(jīng)乙?；?、水解、高錳酸鉀氧化、酸化得5-甲基吡嗪-2-羧酸，總收率約47%。此路線步驟長而復雜，總收率較低，高錳酸鉀氧化成本高，需要氮氣保護；且含錳廢水不好處理，環(huán)境污染嚴重。

.環(huán)合、氧化、酸化和脫羧法。采用順-2,3-二氨基-2-丁烯-1,4-二腈為原料，經(jīng)與丙酮醛環(huán)合、硫酸水解得2-甲基吡嗪-5,6-二羧酸，再經(jīng)脫羧得5-甲基吡嗪-2-羧酸。此路線步驟長而復雜，順-2,3-二氨基-2-丁烯-1,4-二腈須進口、價格高，在2-甲基吡嗪-5,6-二羧酸脫羧時得到5-甲基吡嗪-2-羧酸和6-甲基吡嗪-2-羧酸兩種異構(gòu)體的混合物，分離純化困難。

.化學合成法還包括分子間環(huán)合法、N-溴代丁二酰亞一步氧化法、環(huán)烷酸鈷一步氧化法以及電化學氧化法等。

目前5-甲基吡嗪-2-羧酸的生產(chǎn)工業(yè)上是以化學法為主。但是化學合成一般需要高溫高壓、惰性氣體保護、大量使用氧化劑，合成過程中產(chǎn)生大量廢棄物，污染環(huán)境。并且化學合成法的總收率低，成本高。

生物法制備5-甲基吡嗪-2-羧酸，底物選擇性好，催化效率較高，雜質(zhì)少，并且污染小，代表著綠色化學的發(fā)展方向。瑞士Lonza公司已經(jīng)實現(xiàn)了利用含二甲苯單加氧酶的菌株在批次補料反應器中制備5-甲基吡嗪-2-羧酸。國內(nèi)浙江工業(yè)大學（鄭裕國等,化學與生物工程,2012,29(9):19~25）篩選獲得一株含二甲苯單加氧酶的惡臭假單胞菌，并利用該菌株進行5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物制備，經(jīng)過補料發(fā)酵產(chǎn)率可達到75.6%，產(chǎn)物濃度達到20.41 g/L，周期達到了22天。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的是克服化學合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工藝的不足，并提供一株具有高區(qū)域選擇性的催化單加氧反應的產(chǎn)二甲苯單加氧酶的菌株HW-1，及利用該菌株發(fā)酵制備5-甲基吡嗪-2-羧酸。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一株產(chǎn)二甲苯單加氧酶的Arthrobacter woluwensis HW-1菌株，其菌種保藏編號為CGMCC 12833。該菌株的保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，菌種保藏編號為CGMCC 12833，保藏日期2016年8月15日。

本發(fā)明提供的菌株是按如下方法篩選獲得：