[發(fā)明專利]快速檢測組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610807600.8
• 申請日: 2016-09-07
• 公開（公告）號: CN107796883A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王擁軍;劉書芬;施杞;喬梁;梁倩倩;李晨光;崔學(xué)軍;張巖;李強(qiáng);孫悅禮;王曉濤;舒冰;王晶;趙東峰;徐浩;姚敏;劉丹
• 申請（專利權(quán)）人: 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 上海中優(yōu)律師事務(wù)所31284
• 代理人: 潘詩孟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及能量代謝物質(zhì)含量檢測的方法，適用于各種動物肌肉組織及線蟲的能量代謝物質(zhì)的含量檢測。以LC-MS/MS(液質(zhì)聯(lián)用)檢測ATP、ADP、AMP、CP、creatine五種能量代謝小分子的含量。

背景技術(shù)

機(jī)體各種能源物質(zhì)在體內(nèi)氧化時所釋放的能量，不足50％的能量可以用于做功的“自由能”。這部分自由能的載體是三磷酸腺苷(ATP)，能量貯存于ATP的高能磷酸鍵中。除ATP外，體內(nèi)還有另一種含有高能磷酸鍵的貯能化合物，即磷酸肌酸(CP)。磷酸肌酸(CP)能在肌酸激酶的催化下，將其磷酸基轉(zhuǎn)移到ADP分子中。當(dāng)一些ATP用于肌肉收縮，就會產(chǎn)生ADP。這時，通過肌酸激酶的作用，磷酸肌酸很快供給ADP以磷酸基，從而恢復(fù)正常的ATP高水平。在活動后的恢復(fù)期中，積累的肌酸又可被ATP磷酸化，重新生成磷酸肌酸。因此，CP常被看作是ATP的貯存庫。肌酸(creatine)，是一種氨基酸衍生物，它可以快速提供能量。在脊椎動物中，creatine與ATP由肌酸激酶催化，可逆地生成CP。如圖1所示，ATP、ADP、AMP、CP、creatine五種能量代謝小分子在組織內(nèi)相互轉(zhuǎn)化。

線蟲能量代謝的水平可以通過腺嘌呤核苷酸含量的變化反映。測定ATP及其代謝產(chǎn)物的含量變化可以判定線蟲的生長狀態(tài)，對研究線粒體能量代謝功能有著重要的意義。

目前，尚無同時檢測某一組織或者線蟲中此五種能量代謝小分子含量的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

為填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中尚無同時檢測某一組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP和creatine五種能量代謝小分子的方法之空白，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，希望提出一種檢驗(yàn)效率高、定量準(zhǔn)確的檢測方法，以滿足同時快速檢測組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine的含量。

根據(jù)實(shí)施例，本發(fā)明提供的一種快速檢測組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其創(chuàng)新點(diǎn)在于，包括如下工藝步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取2mg ATP、ADP、AMP、CP和creatine標(biāo)準(zhǔn)品,分別用1mL超純水溶解，避光-80℃保存；取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL混勻，用甲醇/水(1：1，體積比)依次稀釋20、40、80、100、160、200、640倍后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；取組織或者線蟲，液氮狀態(tài)下研碎混勻或者加高氯酸溶液勻漿，加入不同濃度的ATP、ADP、AMP、CP和creatine標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，分別配制成自10.0到50000.0不同梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)組織液體樣品；前述所有操作均在4℃以下進(jìn)行；標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍采用外標(biāo)法定量；

(2)分析樣品的配制

組織用靈敏度為0.0001g的電子分析天平稱重后，迅速置于預(yù)冷的玻璃組織研磨器中液氮狀態(tài)下研碎混勻或者用勻漿器打碎,加入10倍量的4℃預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻2min；再4℃低溫離心離心，14000轉(zhuǎn)/分鐘，15min，取上清液；上清液用4℃預(yù)冷的甲醇/水(1:1，體積比)稀釋10倍，高速離心14000轉(zhuǎn)/分鐘，再次取得的上清液，即為供試品溶液，-80℃儲存待測；

收集線蟲，用濃度為0.1mol/L的高氯酸溶液在冰浴下充分勻漿，取全部勻漿液于4℃、14000r/min離心10min，取出上清液重復(fù)離心一次，并用0.22μm微孔濾膜過濾后,-80℃儲存待測；

(3)精密度試驗(yàn)

精密吸取5種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入組織或者線蟲中配制低(20.0ng/mL)、中(100.0ng/mL)、高(1000.0ng/mL)質(zhì)量濃度的樣品，注入LC-MS/MS，用外標(biāo)法測定組織或者線蟲中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量；

所述LC-MS/MS的液相條件為：thermo C18色譜柱；流動相A：乙腈:1mM醋酸銨水溶液(pH＝10)＝100：1，流動相B：1mM醋酸銨水溶液(pH＝10)；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣盤溫度：4℃；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10ul；流動相梯度如表1所示；

所述LC-MS/MS的質(zhì)譜條件為：采用選擇離子監(jiān)測模式掃描，以負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，利用ESI電噴霧離子源，負(fù)離子噴霧電壓為2500V，霧化溫度100℃，離子傳輸毛細(xì)管溫度為350℃，以氬氣作為Q2碰撞氣為，壓力為1.5mTorr，掃描寬度選擇0.002m/z，掃描時間選擇0.100s。

表1.梯度洗脫條件