[發(fā)明專利]快速檢測(cè)組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610807600.8
• 申請(qǐng)日: 2016-09-07
• 公開（公告）號(hào): CN107796883A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王擁軍;劉書芬;施杞;喬梁;梁倩倩;李晨光;崔學(xué)軍;張巖;李強(qiáng);孫悅禮;王曉濤;舒冰;王晶;趙東峰;徐浩;姚敏;劉丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 上海中優(yōu)律師事務(wù)所31284
• 代理人: 潘詩(shī)孟

1.一種快速檢測(cè)組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，包括如下工藝步驟：

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取2mg ATP、ADP、AMP、CP和creatine標(biāo)準(zhǔn)品,分別用1mL超純水溶解，避光-80℃保存；取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL混勻，用體積比為1:1的甲醇和水依次稀釋20、40、80、100、160、200、640倍后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；取組織或者線蟲，液氮狀態(tài)下研碎混勻或者加高氯酸溶液勻漿，加入不同濃度的ATP、ADP、AMP、CP和creatine標(biāo)準(zhǔn)溶液混勻，分別配制成自10.0到50000.0不同梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)組織液體樣品；前述所有操作均在4℃以下進(jìn)行；標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍采用外標(biāo)法定量；

(2)分析樣品的配制

組織用靈敏度為0.0001g的電子分析天平稱重后，迅速置于預(yù)冷的玻璃組織研磨器中液氮狀態(tài)下研碎混勻或者用勻漿器打碎,加入10倍量的4℃預(yù)冷的甲醇，漩渦混勻2min；再4℃低溫離心離心，14000轉(zhuǎn)/分鐘，15min，取上清液；上清液用4℃預(yù)冷的體積比為1:1的甲醇和水稀釋10倍，高速離心14000轉(zhuǎn)/分鐘，再次取得的上清液，即為供試品溶液，-80℃儲(chǔ)存待測(cè)；

收集線蟲，用濃度為0.1mol/L的高氯酸溶液在冰浴下充分勻漿，取全部勻漿液于4℃、14000r/min離心10min，取出上清液重復(fù)離心一次，并用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后,-80℃儲(chǔ)存待測(cè)；

(3)精密度試驗(yàn)

精密吸取5種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入組織或者線蟲中配制質(zhì)量濃度分別為20.0ng/mL、100.0ng/mL和1000.0ng/mL的樣品，注入LC-MS/MS，用外標(biāo)法測(cè)定組織或者線蟲中的ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量；

所述LC-MS/MS的液相條件為：thermo C18色譜柱；流動(dòng)相A：乙腈:1mM醋酸銨水溶液＝100：1，流動(dòng)相B：1mM醋酸銨水溶液；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣盤溫度：4℃；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10ul；流動(dòng)相梯度如表1所示，前述1mM醋酸銨水溶液的pH＝10；

所述LC-MS/MS的質(zhì)譜條件為：采用選擇離子監(jiān)測(cè)模式掃描，以負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)，利用ESI電噴霧離子源，負(fù)離子噴霧電壓為2500V，霧化溫度100℃，離子傳輸毛細(xì)管溫度為350℃，以氬氣作為Q2碰撞氣為，壓力為1.5mTorr，掃描寬度選擇0.002m/z，掃描時(shí)間選擇0.100s。

表1.梯度洗脫條件

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，所述組織為心臟或肌肉。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述所述的快速檢測(cè)組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，進(jìn)一步包括如下工藝步驟：

精密吸取5種混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入組織或者線蟲中，按LC-MS/MS的液相條件和質(zhì)譜條件測(cè)定，樣品于4℃分別放置0,1,2,4,24h時(shí)ATP、ADP、AMP、CP和creatine的含量，以判斷樣品的穩(wěn)定性。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測(cè)組織或者線蟲中ATP、ADP、AMP、CP以及creatine含量的方法，其特征是，進(jìn)一步包括如下工藝步驟：

精密吸取5種混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入組織或者線蟲中，渦旋混勻，按LC-MS/MS的液相條件和質(zhì)譜條件測(cè)定，計(jì)算ATP、ADP、AMP、CP以及creatine的回收率。