[發明專利]一種豬圓環病毒II型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201610806538.0
• 申請日: 2016-09-07
• 公開（公告）號: CN106399350B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發明（設計）人: 呂紅;周峻崗;段進坤;余垚
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N1/19;C12N7/04;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發明提供了一種豬圓環病毒II型衣殼蛋白重組表達的馬克斯克魯維酵母工程菌，將豬圓環病毒II型衣殼蛋白基因克隆到表達載體中，并在馬克斯克魯維酵母中重組表達獲得豬圓環病毒II型病毒樣顆粒。本發明還提供了一種豬圓環病毒II型病毒樣顆粒疫苗的制備方法，通過重組馬克斯克魯維酵母的高密度發酵，獲得豬圓環病毒II型病毒樣顆粒，經分離純化制備疫苗。本發明提供的豬圓環病毒II型病毒樣顆粒疫苗，注射免疫一次即可獲得高水平血清IgG抗體，具有免疫效果好、安全性高、培養操作簡單，產量高、生產成本低以及可大規模放大生產等優點，可應用于減少、預防感染豬圓環病毒PCV2所引起相關性臨床癥狀。

技術領域

本發明涉及一種重組豬圓環病毒II型病毒樣顆粒疫苗及其制備方法，尤其涉及一種利用馬克斯克魯維酵母高產量、低成本制備豬圓環病毒II病毒樣顆粒疫苗的方法、以及一種免疫效果好、安全性高的豬圓環病毒II型病毒樣顆粒疫苗。

背景技術

豬圓環病毒(Porcine circovirus,PCV)是迄今發現最小的動物病毒之一，屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是無囊膜的單股環狀負鏈DNA病毒，20面體對稱，直徑17-20nm，已知PCV具有兩個血清型，即豬圓環I型病毒(PCV1)和豬圓環II型病毒(PCV2)，其中，PCV 1為非致病性病毒，PCV2為致病性的病毒。

PCV對養豬業的危害巨大，在世界范圍內廣泛流行。豬感染后表現為消瘦，淋巴結腫大，氣喘，拉稀，還會引起母豬的繁殖障礙性疾病。PCV還會破環感染豬體的免疫系統，造成免疫抑制，引發疫苗免疫失敗。臨床上，PCV往往跟豬瘟，高致病性藍耳病，豬細小病毒等混合感染，在豬群中造成了很高的感染率和死亡率。目前，還沒有針對該病的特效藥物，疫苗接種仍然是防控PCV疾病的最有效措施。

更為嚴峻的是，我國養豬業中的PVC2已呈現感染日齡早(產房哺乳仔豬即可感染)的狀況。因此PCV2已被認為是世界養豬業的重要病原，能引起豬的免疫抑制，造成二重或者三重感染，發病率和死亡率高，給養豬業帶來重大危害、和嚴重的經濟損失。目前，PCV2疫苗已經成為繼豬瘟、口蹄疫、藍耳病和偽狂犬等疫苗后用量最大、用量最多的豬病疫苗品種，市場需求量大。

商品化的疫苗主要有滅活疫苗和亞單位疫苗(類病毒顆粒疫苗)兩類，免疫效果都很好，對PCV疾病的防控具有重要意義。其中，亞單位疫苗因其安全性較高，免疫效果確切，成為臨床使用的首選疫苗。

PCV病毒基因組大小約為1700bp，包含有11個開放閱讀框(open reading frame,ORF)，其中ORF1和ORF2是主要的開放閱讀框，分別編碼非結構蛋白Rep和結構蛋白Cap。Cap蛋白是病毒主要的衣殼蛋白，含有很多保護性抗原決定簇，是疫苗設計的靶標蛋白。目前市場上銷售的PCV-2Cap蛋白類病毒顆粒疫苗有兩類：

A)一類是大腸桿菌制備的PCV2類病毒顆粒(原核表達)，PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入大腸桿菌原核載體中去，利用大腸桿菌表達PCV-2Cap蛋白，制備亞單位疫苗。大腸桿菌表達系統具有生長速度快、易培養、表達蛋白產量高等特點，但其表達的蛋白大多以無活性的包涵體形式存在，經過蛋白變性復性等一系列操作后，可以得到可溶性蛋白。但是原核表達容易出現不具備活性的包涵體，需要進行蛋白復性來提高疫苗效果，成本高，生產周期長(每批次耗時約2-3個月)、效率低，獲得的蛋白免疫原性較差；特別是大腸桿菌表達的蛋白雖然經過純化，依然有可能殘留內毒素，免疫動物會產生副反應。

B)另一類由桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統表達制PCV2類病毒顆粒疫苗由桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統表達的類病毒顆粒(真核表達)，用PCV-2的ORF2基因(Cap蛋白)插入到昆蟲桿狀病毒，用昆蟲細胞培養，獲得重組的PCV-2Cap蛋白，經純化、與免疫佐劑混合后獲得，在臨床上以注射方式免疫，真核表達的工藝要求較高，產品中可能會混有桿狀病毒顆粒，產生副反應，存在一定的生物安全風險。

發明內容