[發明專利]一種高特異性的CRISPR基因組編輯體系

有效

• 申請號: 201610805040.2
• 申請日: 2016-09-06
• 公開（公告）號: CN107794272B
• 公開（公告）日: 2021-10-12
• 發明（設計）人: 丁秋蓉;陳彥好
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海營養與健康研究所
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 陳詳;馬莉華

本發明提供了一種高特異性的CRISPR基因組編輯體系，通過在CRISPR/Cas9基因組編輯系統中引入靶向Cas9基因的gRNA，在靶細胞基因組編輯進行的同時(或之后)，靶向Cas9基因的gRNA能夠介導對Cas9基因的切割，從而顯著降低Cas9基因的表達時間，繼而降低由于CRISPR體系中Cas9長期表達導致的脫靶效應，增加靶向特異性。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種高特異性的CRISPR基因組編輯體系。

背景技術

基因組編輯技術(Genome Editing)，是一種能夠對目的基因組進行定點改造，從而對未知功能基因進行研究和基因治療的技術。人工核酸內切酶介導的基因組編輯技術目前應用最普遍，其優勢是擺脫傳統技術對于胚胎干細胞的依賴并且使用范圍廣，在臨床應用上有很大的潛力。人工核酸內切酶介導的基因組編輯技術主要包括鋅指核酸酶技術(ZFNs)、類轉錄激活因子核酸酶技術(TALENs)以及CRISPR/Cas技術。

ZFNs是最早發展的通用基因組編輯技術,可用以實施定點敲除和定點敲入變異，但ZFNs技術的發展受限于構建難度大、成本高等缺點。TALENs技術在ZFNs基礎上發展而來，較ZFNs技術而言,TALENs技術具備構建靈活度高、成本低等優勢。不同于ZFNs與TALENs技術，CRISPR/Cas技術具有獨特的DNA靶向機制，使用更加方便和靈活，因此正在發展成為主要的基因組編輯工具。目前，CRISPR/Cas系統已在多種物種中測試成功,例如小鼠、斑馬魚、果蠅、線蟲和家蠶。

但是，在基因組編輯中存在的脫靶效應一直阻礙著基因組編輯技術更廣范圍的應用，因此，本領域迫切需要開發靶向特異性更強的基因組編輯技術。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高特異性的基因組編輯體系及其應用。

本發明的第一方面，提供了一種高特異性的CRISPR基因組編輯系統，其中，所述CRISPR基因組編輯系統包括：第一gRNA、第二gRNA、和Cas9蛋白；其中，所述第一gRNA靶向待編輯的靶細胞的基因組，所述第二gRNA靶向所述Cas9蛋白的編碼基因。

在另一優選例中，所述第二gRNA靶向選自下組的基因序列：SEQ ID NO.3、和SEQID NO.4。

在另一優選例中，CRISPR基因組編輯系統包括下式(I)所示的DNA構建物：

P1-R1-P2-R2-P3-C，(I)

式(I)中，R1為第一gRNA編碼基因、R2為第二gRNA編碼基因、C為Cas9蛋白編碼基因，P1、P2、P3為任選地啟動子序列，“-”表示任選地的連接序列。

本發明的第二方面，提供了一種用于CRISPR基因組編輯的DNA構建物，所述DNA構建物具有下式(I)所示的結構：

P1-R1-P2-R2-P3-C，(I)

式(I)中，R1為第一gRNA編碼基因、R2為第二gRNA編碼基因、C為Cas9蛋白編碼基因，P1、P2、P3為任選地啟動子序列，“-”表示任選地的連接序列。

在另一優選例中，所述第二gRNA靶向選自下組的基因序列：SEQ ID NO.3、和SEQID NO.4。

本發明的第三方面，提供了一種表達載體，所述表達載體表達本發明第一方面所述的CRISPR基因組編輯系統；或者，所述表達載體含有本發明第二方面所述的DNA構建物。

本發明的第四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有本發明第三方面所述的表達載體，或其基因組中整合有本發明第二方面所述的DNA構建物。

在另一優選例中，所述宿主細胞為真核細胞，較佳地為動物細胞。