[發明專利]一種利用級聯放大效應高敏監測水體PAHs的轉熒光蛋白基因斑馬魚的研制方法

有效

• 申請號: 201610802421.5
• 申請日: 2016-09-05
• 公開（公告）號: CN106399368B
• 公開（公告）日: 2019-06-28
• 發明（設計）人: 裴得勝;賀超;謝少林;馬彥博
• 申請（專利權）人: 中國科學院重慶綠色智能技術研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027;G01N21/64;G01N33/18
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 李艷;許亦琳

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用級聯放大效應高敏監測水體PAHs污染物的轉熒光蛋白基因斑馬魚的研制方法。所述方法以UAS?Gal4基因表達調控系統為基礎，利用優化重組的多環芳香烴響應元件AhREs驅動上游質粒Gal4的表達，進而對下游UAS質粒中熒光基因eGFP表達進行調控；同時創新性結合TALE?TF轉錄激活增強技術，通過TALE轉錄激活效應進一步增強eGFP基因的表達量，達到多重增加熒光信號的目的；最終利用I?SceI大范圍核酸酶轉移系統，可以獲得穩定遺傳的低拷貝誘導性轉熒光蛋白基因斑馬魚，對斑馬魚毒性影響較小。通過制作對環境污染物高敏的轉熒光蛋白基因斑馬魚，實現對水體中有毒污染物的簡單、高效、靈敏、直觀的監測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用級聯放大效應高敏監測水體PAHs污染物的轉熒光蛋白基因斑馬魚的研制方法。

背景技術

現階段環境污染尤其是水污染在世界各地普遍存在。水質的污染不僅會影響水生生物的生存與繁殖，而且污染物會通過生物富集濃縮作用到達食物鏈的終端，嚴重影響人類健康。近年來，人們在環境中頻繁地檢測出多環芳烴等有機污染物，研究表明這類污染物已對水環境、土壤及沉積物中生物的生存造成了嚴重威脅。其中環境水體中的有機污染物以芳香烴類污染物為主。傳統檢測芳香烴類污染物毒性效應的方法一般分為體外測試(Invitro test)和體內測試(In vivo test)。但是體外測試不能體現對整個生物體的影響，體內測試又具有操作繁瑣、實驗昂貴且對低濃度暴露的反應不穩定等問題，因此，目前研究中較傾向于利用組合分層式檢測方法(Tiered test)測試芳香烴類污染物的毒性效應。但是該方法仍耗時、耗力且需要專業技術人員完成，而且不能用于現場直觀監測。

斑馬魚以其獨特性可作為理想的環境監測模式生物。現階段，已有部分國家使用野生型斑馬魚對水體環境進行監測，轉基因魚監測該類污染物的技術也隨之產生。2001年Mattingly等首次證實斑馬魚的轉錄因子可以識別人的AhREs，在TCDD的誘導下可驅動GFP的表達，但是他們僅研究了芳香烴受體及其下游基因的功能，并沒有將其應用于活體監測芳香烴類污染物。Payne觀察到在石油污染的海水中，可誘導青鱸的CYP1A1活性出現變化，并通過檢測苯并芘羥化酶的活性誘導效果監控海上的石油污染。此后，Nebert等利用包含AhREs的啟動子驅動LUC報告基因的表達，研制出轉基因斑馬魚來檢測水體中芳香烴族有機污染物,但他們研制的轉基因斑馬魚中LUC報告基因不能傳至F₂代。

發明內容

為了克服現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供一種利用級聯放大效應高敏監測水體PAHs污染物的轉熒光蛋白基因斑馬魚的研制方法。

為了實現上述目的以及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：

本發明的第一方面，提供一種監測水體環境污染物的轉熒光蛋白基因魚的培養方法，包括步驟：

(1)提供水體環境污染物響應載體，所述水體環境污染物響應載體帶有I-SceI大范圍核酸酶轉移系統，所述水體環境污染物響應載體包括：水體環境污染物響應元件、轉錄激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和熒光蛋白序列；

(2)提供熒光信號放大載體，包括步驟：在步驟(1)所述水體環境污染物響應載體的熒光蛋白序列之后克隆入轉錄激活因子TALE-VP64編碼序列，獲得熒光信號放大載體；

(3)將水體環境污染物響應載體和熒光信號放大載體與I-SceI酶共同注射入魚的受精卵，培養，獲得監測水體環境污染物的轉熒光蛋白基因魚。

優選地，所述魚為斑馬魚，但是在其他魚類也可適用。

優選地，所述水體環境污染物響應元件為多環芳香烴響應元件，本方法但同樣也適用于雌激素反應元件EREs、金屬反應原件MREs和親電性響應元素EpREs等。所述多環芳香烴響應元件含有如SEQ ID NO.16所示的序列。