[發(fā)明專利]一種利用級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)高敏監(jiān)測(cè)水體PAHs的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚的研制方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610802421.5
• 申請(qǐng)日: 2016-09-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106399368B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-06-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 裴得勝;賀超;謝少林;馬彥博
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;A01K67/027;G01N21/64;G01N33/18
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 李艷;許亦琳

1.一種監(jiān)測(cè)水體環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的培養(yǎng)方法，包括步驟：

(1)提供水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體帶有I-SceI大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體包括：水體環(huán)境污染物響應(yīng)元件、轉(zhuǎn)錄激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和熒光蛋白序列；

(2)提供熒光信號(hào)放大載體，包括步驟：在步驟(1)所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體的熒光蛋白序列之后克隆入轉(zhuǎn)錄激活因子TALE-VP64編碼序列，獲得熒光信號(hào)放大載體；

(3)將水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體和熒光信號(hào)放大載體與I-SceI酶共同注射入魚的受精卵，培養(yǎng)，獲得監(jiān)測(cè)水體環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚，所述魚選自斑馬魚，所述水體環(huán)境污染物選自多環(huán)芳香烴類污染物，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)元件選自多環(huán)芳香烴響應(yīng)元件AhREs。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還含有以下特征的任一項(xiàng)或多項(xiàng)：

1)所述多環(huán)芳香烴響應(yīng)元件的序列如SEQ ID NO.16所示；

2)所述熒光蛋白選自eGFP、RFP、CFP、YFP或mCherry；

3)所述轉(zhuǎn)錄激活因子TALE-VP64的序列如SEQ ID NO.17所示。

3.根據(jù)權(quán)利要1所述的方法，其特征在于，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體的序列如SEQIDNO.14所示。

4.根據(jù)權(quán)利要1所述的方法，其特征在于，所述熒光信號(hào)放大載體的序列如SEQ IDNO.15所示。

5.根據(jù)權(quán)利要1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)還包括純系轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚的篩選，包括步驟：將注射后的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚P₀培育至性成熟，然后與野生型魚雜交，收集魚卵，TCDD暴露，篩選出可表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₁代；將所述轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₁代再與野生型斑馬魚進(jìn)行雜交，收集魚卵，TCDD暴露，篩選出可表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚雜合體F₂代；然后將雜合體F₂代雌雄魚進(jìn)行自交，篩選出其中轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚F₃代中的純合體，即為純系轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚。

6.由如權(quán)利要求1～5任一權(quán)利要所述方法培養(yǎng)獲得的轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚用于檢測(cè)水環(huán)境污染物的用途，所述轉(zhuǎn)熒光蛋白基因魚選自轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚，所述水體環(huán)境污染物選自多環(huán)芳香烴類污染物。

7.一種載體組合，包括：水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體和熒光信號(hào)放大載體，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體帶有I-SceI大范圍核酸酶轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體包括：水體環(huán)境污染物響應(yīng)元件、轉(zhuǎn)錄激活Gal4蛋白的基因序列、UAS序列和熒光蛋白序列；所述熒光信號(hào)載體為在所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)載體的熒光蛋白序列之后克隆入轉(zhuǎn)錄激活因子TALE-VP64編碼序列獲得，所述水體環(huán)境污染物響應(yīng)元件選自多環(huán)芳香烴響應(yīng)元件AhREs。

8.根據(jù)權(quán)利要7所述的載體組合用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)熒光蛋白基因斑馬魚的用途。