[發明專利]用于高等真菌基因中斷的方法

有效

• 申請號: 201610794735.5
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN107779466B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 肖晗;秦浩;鐘建江
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/113;C12N15/55;C12N1/15
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

一種用于高等真菌基因中斷的方法，通過將含有密碼子優化的Cas9基因的表達載體轉入單倍體靈芝(Ganoderma lucidum，CGMCC NO.5.26)中，獲得了可穩定表達Cas9蛋白的靈芝菌株；然后將經體外轉錄的gRNA轉入此表達Cas9蛋白的靈芝菌株中，通過gRNA識別靶向基因，實現靶向基因的特定位點的中斷，并以U6snRNA啟動子介導gRNA內源轉錄，同樣使靶向基因的特定位點中斷。本發明以靈芝作為模式物種，提供了包含密碼子優化的Cas9基因的表達載體和宿主細胞，提供了通過外源轉錄合成gRNA或內源U6small nuclear RNA(U6 snRNA)啟動子轉錄合成gRNA兩種方式構建CRISPR/Cas9基因組編輯的方法。

技術領域

本發明涉及的是一種基因工程領域的技術，具體是一種利用CRISPR/Cas9技術的原理，將Cas9基因及特異的gRNA導入高等真菌細胞從而實現基因中斷的方法。

背景技術

高等真菌(higher fungi or mushrooms)是指能形成大型子實體，菌絲含有隔膜，并且在有性生殖階段能產生分生孢子的真菌，包括部分子囊菌(Ascomycotina)、擔子菌(Basidiomycotina)和半知菌(Deuteromycotina)，常見的高等真菌有茯苓、銀耳、冬蟲夏草、猴頭、香菇、靈芝等。高等真菌是天然產物的寶庫，它們所產的真菌多糖、甾醇、生物堿、萜類具有提高人體免疫力、抗腫瘤、抗菌等生物活性。因此，高等真菌是具有強大的藥物生產潛力的一類微生物，受到學術界和工業界的廣泛關注。

然而，高等真菌中缺乏成熟的遺傳操作系統，特別是基因中斷技術，極大的限制了人們對該類微生物代謝調控的認識，以及進一步的遺傳改造。在已有的報道中，基因中斷主要是通過同源重組的方式進行的，而高等真菌中同源重組效率極低，比如，在裂褶菌(Schizphylhlscommne)中同源重組的比例僅為3.25％，在對現有方法進行改進的嘗試中，研究者通過預先敲除裂褶菌的ku80基因，減少非同源性末端連接(NHEJ)的發生幾率，使得同源重組效率提高，通過這一方式人們在裂褶菌、平菇、灰蓋鬼傘等個別高等真菌中應用了基因中斷技術。然而該技術還存在很大的問題，需要預先以同源重組的方式敲除ku80/ku70基因，存在操作困難、效率低下、耗時耗力等問題，大大限制了這一技術的可行性；同時ku80基因的缺失會大大降低原生質體的再生率從而降低基因轉化效率，因此大多數具有重要藥用價值的高等真菌如茯苓、靈芝、香菇等尚未見基因中斷的報道。(Lugones,L.G.,De Jong,J.F.,De Vries,O.M.H.,Jalving,R.,Dijksterhuis,J.,H.A.B.Mol Microbiol,2004,53(2):707-716.De Jong,J.F.,Ohm,R.A.,De Bekker,C.,H.A.,Lugones,L.G.FEMS Microbiol Lett,2010,310(1):91-95.Takahashi,T.,Masuda,T.,Koyama,Y.Mol Genet Genomics,2006,275(5):460-470.)