[發明專利]用于高等真菌基因中斷的方法有效
| 申請號： | 201610794735.5 | 申請日： | 2016-08-31 |
| 公開（公告）號： | CN107779466B | 公開（公告）日： | 2021-01-08 |
| 發明（設計）人： | 肖晗;秦浩;鐘建江 | 申請（專利權）人： | 上海交通大學 |
| 主分類號： | C12N15/80 | 分類號： | C12N15/80;C12N15/113;C12N15/55;C12N1/15 |
| 代理公司： | 上海交達專利事務所 31201 | 代理人： | 王毓理;王錫麟 |
| 地址： | 200240 *** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 用于 高等 真菌 基因 中斷 方法 | ||
1.一種用于高等真菌基因中斷的方法，其特征在于，通過將含有密碼子優化的Cas9基因的表達載體轉入單倍體靈芝
所述的Cas9基因，含有SV40 NLS核定位信號，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述的gRNA為針對靈芝
用于體外轉錄的gRNA1序列，即5’ GGAGCAGAAGCCCCCTGCCA 3’，具體如SEQ ID No.26所示，或gRNA2序列，即5’ GGCCTCTTCCGTGTATGAGC 3’ ，具體如SEQ ID No.27所示，或
用于內源轉錄的gRNA3序列，即5’ AACCGGCTCATACACGGAAG 3’ ，具體如SEQ ID No.25所示。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的體外轉錄，即構建gRNA1和gRNA2體外轉錄的DNA模版，通過MEGAscript T7進行體外轉錄。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的DNA模板，通過以下方式得到：使用人工合成gRNA的方法，并合成打靶同源片段序列，選用目標基因為
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的內源轉錄，即根據具有RNApolymerase III活性的靈芝內源的U6 snRNA啟動子構建內源gRNA表達載體pU1-gRNA3和pU4-gRNA3，通過MEGAscript T7進行內源轉錄。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的內源gRNA表達載體pU1-gRNA3和pU4-gRNA3，通過以下方式得到：通過如Seq ID No.17所示所示的pU6-1和如Seq ID No.18所示的pU6-4基因，分別對應采用如Seq ID No.19所示的正向引物U6-F1和如Seq ID No.20所示的反向引物U6-R1以及采用如Seq ID No.21所示的正向引物U6-F4和如Seq ID No.22所示的反向引物U6-R4分別通過PCR擴增出U6-1啟動子和U6-4啟動子；然后通過如Seq IDNo.23所示的正向引物sgRT-F和如Seq ID No.24所示的反向引物sgRT-R擴增出gRNA末端序列，使用XmaI，SphI，BsaI酶切上述片段后，用T4連接酶連接到pUC19表達載體上，從而構建出表達載體pUC-U6-1和pUC-U6-4；最后使用BbsI酶切上述載體，將退火形成雙鏈的gRNA3，即Seq ID No.25連接到表達載體上，得到gRNA內源表達載體pU1-gRNA3和pU4-gRNA3。
6.根據權利要求1、4或5所述的方法，其特征在于，所述的Cas9基因的表達載體，為pMD-Glcas9質粒，其骨架為pMD18-T，且含有上述Cas9基因、啟動子Pgpd、終止子Tpdc以及選擇標記基因
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的啟動子P
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