[發(fā)明專利]基于PPARγ信號通路的藥物篩選模型的構(gòu)建和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610786995.8
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN107779454A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊金波
• 申請（專利權(quán)）人: 上海米絡(luò)凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司31100
• 代理人: 韋東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種基于PPARγ信號通路的藥物篩選模型的構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，隨著生活水平的提高，人們的飲食結(jié)構(gòu)和習(xí)慣在不斷變化，而由此引發(fā)的高血壓、高血脂、糖尿病、動脈粥樣硬化、冠心病、肥胖癥和癌癥也正困擾著越來越多的人，與此同時隨著科學(xué)研究的不斷深入，也發(fā)現(xiàn)上述疾病的相關(guān)性十分的密切。PPARs(過氧化物酶體增殖物激活受體，Peroxisome proliferator-activated receptors)，是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員(Zhu，Kan等，2000)。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，PPARs可分為PPARα、β、γ三種亞型(Berger和Moller，2002)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PPARs可調(diào)節(jié)基因的表達，在細(xì)胞分化、發(fā)育、代謝和腫瘤發(fā)生上都起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，其中對PPARγ的研究最為深入，其主要表達于脂肪組織及免疫系統(tǒng)，與脂肪細(xì)胞分化、機體免疫及胰島素抵抗關(guān)系密切(Michalik等，2006)。PPARγ與許多疾病的發(fā)病機理有關(guān)，比如糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化和癌癥等(Berger和Moller，2002)，PPARγ具有調(diào)控脂肪酸儲存和葡萄糖代謝的作用，而PPARγ下游基因可以促進細(xì)胞脂質(zhì)的攝取并加速脂肪的生成。PPARγ也可通過抑制影響NF-κB、STATs、激活蛋白-1等信號通路來抑制靶基因啟動子激活和轉(zhuǎn)錄。PPARγ還可以降低很多心血管細(xì)胞，特別是內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)(Hamblin等，2009)。PPARγ還能活化PON1基因，增加肝臟對氧磷酶的合成和釋放，進而降低動脈粥樣硬化的發(fā)生幾率(Khateeb等，2010)。PPARγ敲除的小鼠在高脂食物投喂處理時不能生成脂肪組織(Jones等，2005)。

作為一種核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子，PPARγ的配基(又稱激活劑)可分為兩種，包括天然配基和合成配基。天然配基有15-脫氧前列腺素J2及其代謝產(chǎn)物和不飽和脂肪酸等；合成配基有胰島素增敏劑噻唑烷酮類化合物(TZDs)，是一種高效配基。1995年TZD類化合物被發(fā)現(xiàn)，它能高效的與PPARγ結(jié)合并活化PPARγ啟動下游基因的表達(Lehmann等，1995)，靶向PPARγ降低血糖，且不增加胰島素分泌以此來治療糖尿病(Forman等，1995)。其中我們用到的陽性對照羅格列酮就屬于此類物質(zhì)，此外還有吡格列酮和曲格列酮，這三種TZD類藥物已被FDA認(rèn)證，用于治療II型糖尿病。也有報道指出吲哚美辛等非甾體類抗炎藥也能結(jié)合并活化PPARγ(Lehmann，Lenhard等，1997)，現(xiàn)如今PPARγ的激動劑已經(jīng)被應(yīng)用于治療高血脂和高血糖(Li等，2008)。而PPARγ的拮抗劑理論上可以抑制脂肪細(xì)胞的生成，防止肥胖，但目前臨床應(yīng)用較少。

到目前為止，國內(nèi)關(guān)于PPARγ的激動劑和拮抗劑的高通量藥物篩選方法大多局限于蛋白質(zhì)水平的小分子化合物篩選，例如SPR技術(shù)，操作比較繁瑣。本發(fā)明通過構(gòu)建一種基于PPARγ信號和熒光素酶報告基因的篩選系統(tǒng)，能夠通過熒光強度判斷藥物的直接作用，從而能夠快速確定與PPARγ信號有關(guān)的候選化合物，靶向性高，可操作性好，更能作為高通量藥物篩選的最佳選擇。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明第一方面提供一種分離的多核苷酸序列，選自：

(1)N1-(AGGTCA-N-AGGTCA)_m-N2；和

(2)(1)所示序列的互補序列；

其中，N1是粘性末端序列或不存在；N2是粘性末端序列或不存在；N為接頭序列，長1－25個堿基，由選自A、G、T和C的堿基組成；m為1－50的整數(shù)。

在一個具體實施方式中，每個重復(fù)單元AGGTCA-N-AGGTCA中的接頭序列N可以相同或不同。

在一個具體實施方式中，m為1－25的整數(shù)。

在一個具體實施方式中，N為T。

在一個具體實施方式中，所述分離的多核苷酸序列選自SEQ ID NO:2。

本發(fā)明第二方面提供一種載體，該載體含有本發(fā)明的分離的多核苷酸序列和熒光素酶報告基因。

在一個具體實施方式中，所述載體中，本發(fā)明分離的多核苷酸序列位于所述熒光素酶報告基因的上游。

本發(fā)明第三方面提供一種慢病毒表達載體，所述載體含有PPARγ表達元件。

本發(fā)明第四方面提供一種試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明所述的含本發(fā)明分離的多核苷酸序列的載體。

在一個具體實施方式中，所述試劑盒還含有含PPARγ表達元件的慢病毒表達載體。