[發明專利]基于PPARγ信號通路的藥物篩選模型的構建和應用

在審

• 申請號: 201610786995.8
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN107779454A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 楊金波
• 申請（專利權）人: 上海米絡凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/867;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司31100
• 代理人: 韋東

1.一種多核苷酸序列，選自：

(1)N1-(AGGTCA-N-AGGTCA)_m-N2；和

(2)(1)所示序列的互補序列；

其中，N1表示粘性末端序列，或不存在；N2表示粘性末端序列，或不存在；N為接頭序列，長1－25個堿基，由選自A、G、T和C的堿基組成；m為1－50、優選3－25的整數。

2.如權利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一種載體，該載體含有權利要求1－2中任一項所述的多核苷酸序列和熒光素酶報告基因，優選地，權利要求1－2中任一項所述的多核苷酸序列位于所述熒光素酶報告基因的上游。

4.一種試劑盒，所述試劑盒含有權利要求3所述的載體，和任選的含PPARγ表達元件的慢病毒表達載體以及任選的將所述表達載體轉入細胞所需的試劑；優選地，所述PPARγ表達元件的序列如SEQ ID NO:1所示。

5.一種細胞，所述細胞具有組成型PPARγ活性，轉入了權利要求3所述的載體，并穩定表達熒光素酶；優選地，所述細胞還轉入了含PPARγ表達元件的慢病毒表達載體；優選地，所述PPARγ表達元件的序列如SEQ ID NO:1所示。

6.如權利要求5所述的細胞，其特征在于，所述細胞為肝臟細胞、單核巨噬細胞和脂肪細胞，優選為人單核巨噬細胞THP-1細胞、人脂肪細胞3T3-L1、人肝癌細胞HepG2或人肝臟ChangLiver細胞。

7.一種以PPARγ為靶點的藥物篩選細胞模型的構建方法，所述方法包括：

(1)提供權利要求3所述的載體，和任選地提供含PPARγ表達元件的慢病毒表達載體；

(2)將權利要求3所述的載體轉入具有組成型PPARγ活性的細胞中；和

(3)任選地，將含PPARγ表達元件的慢病毒表達載體轉入步驟(2)所得的細胞中。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括

(A)在步驟(2)之后加入嘌呤霉素進行陽性克隆篩選以得到存活細胞的步驟，和任選的在所述篩選步驟之后對得到的每個克隆進行熒光素酶活性鑒定的步驟；和/或

(B)轉入含有PPARγ表達元件的慢病毒表達載體之后，使用嘌呤霉素做陽性篩選得到存活的克隆細胞的步驟。

9.權利要求3所述的載體或權利要求4所述的試劑盒在制備以PPARγ為靶點的藥物篩選細胞模型中的應用，或權利要求5－6中任一項所述的細胞在篩選PPARγ相關的抗動脈粥樣硬化疾病相關的激動劑中的應用。

10.一種篩選抗動脈粥樣硬化相關疾病的激動劑的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供權利要求5－6中任一項所述的細胞；

(2)使所述細胞與待篩選化合物接觸；和

(3)加入熒光素酶底物，并根據熒光激活數據獲得初篩化合物；

任選地，所述方法還包括對初篩得到的化合物進行細胞毒性MMT實驗，基于所獲得的熒光激活率，得到復篩化合物。