[發明專利]一種多點整合的重組蛋白表達方法

有效

• 申請號: 201610786942.6
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN107778365B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 項煒;陳忠;李鑫
• 申請（專利權）人: 通化安睿特生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種重組表達人血清白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 提供重組畢赤酵母細胞，所述的重組畢赤酵母細胞的基因組中，整合有2個人血清白蛋白的基因表達盒，其從5’至3’依次包括：AOX啟動子序列、人血清白蛋白前體肽編碼序列、翻譯終止子序列，這些序列操作性相連，所述的人血清白蛋白前體肽編碼序列包括：人血清白蛋白信號肽和成熟肽編碼序列；所述的人血清白蛋白的N端帶有人血清白蛋白信號肽；所述2個人血清白蛋白的基因表達盒分別整合到所述重組畢赤酵母細胞的基因組中以下的兩個基因座位上：1號染色體his4基因座位，4號染色體AOX1基因座位；將一個人血清白蛋白的基因表達盒設置于pPICZαA表達載體中，另一人血清白蛋白的基因表達盒設置于pPIC9表達載體中；其中，采用攜帶血清白蛋白表達盒的pPICZαA載體轉染，抗性篩選出陽性克隆，以它為宿主菌轉染攜帶血清白蛋白表達盒的pPIC9載體，再次通過組蛋白缺陷性的平板篩選出陽性克隆，得到兩份拷貝攜帶白蛋白表達盒的工程菌株；由于pPICZαA載體只整合在AOX基因區域，AOX基因位于4號染色體上，故該白蛋白表達盒整合在4號染色體上；pPIC9載體用SalI或StuI酶線性化，使pPIC9載體整合到His4區域，而His4位于1號染色體上，這樣，兩份拷貝空間距離大，減少了兩份拷貝在轉錄上的干擾；和

(2) 培養(1)的重組畢赤酵母細胞，從而表達人血清白蛋白。

2.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的畢赤酵母細胞是畢赤酵母細胞GS115。