[發明專利]一種多點整合的重組蛋白表達方法

有效

• 申請號: 201610786942.6
• 申請日: 2016-08-31
• 公開（公告）號: CN107778365B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 項煒;陳忠;李鑫
• 申請（專利權）人: 通化安睿特生物制藥股份有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發明涉及一種多點整合的重組蛋白表達方法，通過將兩個人血清白蛋白的基因表達盒分散定點整合在酵母細胞的基因組中，從而獲得表達效率顯著提高的重組菌株。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種多點整合的重組蛋白表達方法，該方法適用于大規模生產。

背景技術

人血清白蛋白是血漿中的主要蛋白成分，由585個氨基酸組成，分子量約為66kD。人血清白蛋白在血液中主要作用是維持正常滲透壓，與鈣離子、脂肪酸、氨基酸、膽紅素和各種藥物相結合，并起到轉運載體的作用。臨床上人血清白蛋白常用于外科手術、出血性休克、燙傷、腎病綜合征導致的白蛋白缺乏癥、腫瘤肝腹水等疾病的治療。

一直以來，人血清白蛋白是從人血液中純化得到的。由于血源匱乏和病毒(肝炎、AIDs)污染等原因，基因重組人血清白蛋白在近十年中得到了國內外大型制藥公司的重視。近年來，采用基因重組的方法，已經在酵母菌(usP5，330，901、JP11-509525、JP6-100592)、大腸桿菌(Lawn，R.M.construction of DNA sequences and their use for microbialproduction 0f proteins，in particularhuman serum albumin“European Patent Appl”(1983)73，p646)、轉基因牛奶(w9602573Al SEPARATION OF HuMAN sERuM ALBuMIN)中表達人血清白蛋白。

盡管現有技術中已經在酵母等菌株中成功表達過人血清白蛋白，然而表達的效率仍然不夠理想。研究人員還經常使用一些其它方法，最常用的方法是通過增加酵母菌株中的蛋白表達盒的拷貝數(即基因劑量)來提高表達量；方式例如在一個載體上串聯兩個或更多目的蛋白表達盒，然后轉入酵母菌株。但是這個策略局限在于，提高拷貝數不一定必然伴隨著目的蛋白表達量的增高。即使有所增高，也不呈現著和表達盒的拷貝數成正相關的狀況。因為蛋白在細胞內的表達量受很多因素的制約，有轉錄階段的調控，翻譯階段的制約，以及翻譯后的蛋白修飾等。另外，本領域也采用同一載體重復轉染的方式，情況視和酵母基因組整合位點數的不同也有所不同。另外，本領域還采用先后轉入不同載體的方式，比如本發明人以前的專利(申請號CN201010551018.2)采取了一種新的方法，分別先后轉入含有人血白蛋白表達盒的pPIC9和pGAP兩個載體到畢赤酵母中，按照這種系統，為了節省成本，生長期使用甘油提供碳源，誘導期使用甲醇，在這兩個階段人血白蛋白都可以表達，故人血清白蛋白表達量比單獨使用pPIC9或pGAP誘導表達要高，但也同時帶來其他的一些問題，比如發酵液中雜蛋白較多不利于下游純化，一種原因可能是這種菌株可使用甘油和甲醇誘導表達，菌株先后使用了兩套表達系統，使其成分復雜；一種可能的原因是人血白蛋白表達的時間過長，在發酵液中降解。并且，GAP是持續性表達的啟動子，在未加入誘導劑以前就開始表達，但此階段AOX1不發揮作用；在加入甲醇且甘油消耗完畢后，GAP不能發揮功能了，這樣雖然有兩個啟動子，但其作用的只有一個；由于發酵時間很長，在甘油生長期就表達的蛋白，在后期降解嚴重，加大了純化的難度；由于工程菌柱前后使用了兩套表達系統，由于這兩套體系使用的酶蛋白都不一樣，導致雜蛋白成分復雜，增加了純化難度。

因此，還需要進一步優化人血清白蛋白的表達方法，以提高表達效率，使得人血清白蛋白真正實現高效地大規模工業化生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種多點整合的重組蛋白表達方法。

在本發明的第一方面，提供一種重組表達人血清白蛋白的方法，所述方法包括：(1)提供重組酵母細胞，所述的重組酵母細胞的基因組中，整合有2個人血清白蛋白的基因表達盒；所述的人血清白蛋白的N端帶有人血清白蛋白信號肽；和(2)培養(1)的重組酵母細胞，從而表達人血清白蛋白。