[發(fā)明專利]專門用于快速大量提取口腔上皮細(xì)胞DNA的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610769029.5
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN107794255A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫麟;馬潔;張同
• 申請（專利權(quán)）人: 天津市康婷生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司12209
• 代理人: 趙瑤瑤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，尤其是一種專門用于快速大量提取口腔上皮細(xì)胞DNA的方法。

背景技術(shù)

基因檢測是通過提取被測者的血液、其他液體或者組織細(xì)胞對DNA進(jìn)行檢測的技術(shù)。目前，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因檢測已經(jīng)逐步成為繼傳統(tǒng)體檢以外的新興的疾病健康檢測手段。

脫氧核糖核酸(DNA)提取是基因檢測的一個基本步驟，也是整個基因檢測的基礎(chǔ)，核酸的濃度和純度的質(zhì)量直接關(guān)系到后續(xù)的檢測能否成功。相較于傳統(tǒng)體檢，基因檢測可以直接提取被測者的口腔上皮細(xì)胞的DNA，具有無痛無創(chuàng)口的優(yōu)勢。因此，口腔上皮細(xì)胞DNA的提取，成為基因檢測的主流DNA提取方法。

目前，市場上，用于口腔上皮細(xì)胞DNA提取的方法主要分為離心柱法和磁珠法。離心柱法的主要原理是：離心柱中的膜可以對細(xì)胞破碎后的DNA的進(jìn)行特異性的吸附，其余的細(xì)胞裂解物由于不能吸附在離心柱上，而被巨大的離心力甩出離心柱，最后對膜進(jìn)行洗脫而得到所需的DNA。離心柱法的主要缺陷是特異性吸附柱對DNA的吸附效率不高，從而導(dǎo)致得到的DNA的量相對較少。磁珠法的主要原理大體與柱提法相似，即通過可對DNA特細(xì)異性吸附的磁珠，使用清洗液對其它的細(xì)胞裂解物進(jìn)行去除。最后由于磁珠具有磁性，可以吸附在磁力架上，所以特異性吸附的DNA不會被清洗，從而達(dá)到分離純化DNA的目的。由于特異性吸附DNA的磁珠不可重復(fù)使用，而且其造價較貴，所以導(dǎo)致磁珠法成本較高。而且這2種方法的操作步驟較為繁瑣，需要花費(fèi)較長的時間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種提取口腔上皮細(xì)胞基因組的DNA方法，能夠穩(wěn)定高效的提取口腔上皮細(xì)胞基因組DNA。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種專門用于快速大量提取口腔上皮細(xì)胞DNA的方法，步驟如下：

⑴收集樣品細(xì)胞

用2個口腔拭子分別刮取口腔左右兩側(cè)的口腔上皮細(xì)胞，并把拭子頭轉(zhuǎn)移到2個含1ml去離子水的1.5ml的離心管中；震動離心管，使細(xì)胞從拭子上盡可能多的脫落，然后將2個含有口腔上皮細(xì)胞的1.5ml管離心，轉(zhuǎn)速：800×g，時間：2分鐘；吸棄上清液，每個EP管加入500μl的無菌水，將其中一個EP管的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個EP管中，離心，轉(zhuǎn)速：800×g，時間：2分鐘；

⑵裂解細(xì)胞

吸棄上清液，向每管中加入500μl的溶液A，溶液A含9.5mmol/L的Tris-Cl，2mmol/L的EDTA，1％的SDS，3％的Triton-100，pH＝8.5，加后加入50μl濃度為1mg/ml的蛋白酶K溶液，渦旋振蕩10秒鐘，放入55℃水浴內(nèi)15分鐘；每5分鐘振蕩一次；

⑶去除蛋白

短暫離心，將管壁上的殘留液體離至管底；加入200μl的醋酸鈉-冰醋酸溶液，劇烈振蕩20秒鐘，管中出現(xiàn)白色絮狀物；12000×g離心3分鐘，使白色物質(zhì)沉淀到離心管底部；

⑷沉淀DNA

吸取400-500μl的上清液到新的EP管中，加入800μl溶液B，溶液B組成為無水乙醇：異丙醇＝1:3，振蕩10秒鐘，使上清液與異丙醇充分混合；12000×g離心3分鐘；

⑸乙醇洗滌

吸棄上清，加入800μl的75％乙醇，振蕩5秒鐘，12000×g離心2分鐘；吸棄上清，重復(fù)上述步驟一次；

⑹溶解DNA

小心吸棄上清，室溫下敞口干燥10分鐘；將DNA溶解到100μl的無菌水中；

⑺保存DNA

將DNA樣品做好標(biāo)記，放于指定位置-20℃或-80℃中保存。

而且，所述醋酸鈉-冰醋酸溶液為3M的Na+，5M的Ac-。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的方法相較于離心柱法和磁珠法，大大降低實(shí)驗(yàn)成本，相較于離心柱法和磁珠法，大大縮短DNA提取時間，相較于磁珠法，大大提高DNA提取的量。DNA純度在合理的區(qū)間范圍之內(nèi)。提取得到的基因組DNA不影響下游的分子實(shí)驗(yàn)。

附圖說明

圖1為口腔上皮細(xì)胞基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；

圖2為qPCR的擴(kuò)增曲線；

表1為不同樣本口腔上皮細(xì)胞基因組DNA濃度、純度的檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。