[發明專利]一種細胞保存液及其在流式樣本保存中的應用

有效

• 申請號: 201610768294.1
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN106386785B
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發明（設計）人: 倪萬茂
• 申請（專利權）人: 浙江博真生物科技有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N33/533;G01N33/574
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙)11348
• 代理人: 侯蔚寰

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，具體而言，本發明涉及用流式細胞儀檢測的含細胞樣本的保存方法。

背景技術

隨著生物、醫學技術的發展，科研檢測、臨床診斷已逐漸上升至細胞、基因水平，作為單細胞或生物離子定量分析重要手段之一的流式細胞技術的應用也日益廣泛。流式細胞術工作原理是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，具有速度快、精度高、準確性好的優點，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。包括本發明人的中國專利第201610027214號在內的許多現有技術著重對流式細胞術本身的步驟和參數進行了研究。

然而，現有技術對于進行流式細胞檢測的樣本及其保存/處理方法的研究較少。美國專利US5753428A公開了一種細胞保存液，然而本發明人發現，由于其中使用了檸檬酸根等物質，使得對血液樣本上的CD33、CD13等標記不穩定，用其保存的樣本時間稍長，進行如中國專利第201610027214號所述的流式細胞檢測，將產生與原始樣本檢測不同的結果。國內對此的研究也很少，例如中國專利第201410534999號公開了一種穩定血液樣品細胞的試劑，盡管其聲稱可用于流式細胞儀檢測，但是作為業內人士，其中使用了具有強細胞毒性和強氧化鋅的重鉻酸鉀，其保存效果還不如目前常用的含多聚甲醛的細胞保存液。

本發明人發現，尤其是本發明人的中國專利第201610027214號所述的流式細胞檢測，其涉及抗體對結果的判讀，因此如果不能及時進行檢測，或者采用合適方式處理樣本，都會造成抗原表達強度發生不成比例的下降，從而使結果準確度大大降低，甚至可以造成白血病/淋巴瘤免疫分型病例的誤診。為此，本發明人在持續的研究下，開發出了一種細胞保存液，可穩定保存樣本至少49天，保證長期保存的骨髓、外周血、組織等標本的質量，從而保證免疫分型、淋巴細胞亞群檢測等多種白細胞相關檢測的結果穩定和正確，特別適用于中國專利第201610027214號所述的流式細胞檢測，實現樣本采集和檢測分離，采集時無需考慮檢測儀器和試劑，為集約化檢測奠定了基礎。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供新的細胞保存液及其制備方法。另外，本發明還涉及基于該細胞保存液的保存含有細胞的樣本的方法、保存產物以及在流式細胞術中的應用等。

具體而言，在第一方面，本發明提供了細胞保存液，其pH7.2～7.5，其中溶質包括Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化鉻以及任選的抗凝劑。其中，可以包括抗凝劑，也可以不包括抗凝劑。通常不包括抗凝劑的細胞保存液保質期更長一些，適合大批量存儲，待分裝時再加入抗凝劑。

細胞保存液由溶質和溶劑組成，其中溶劑通常是水，優選是純水。優選在本發明第一方面的細胞保存液中，溶質由Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化鉻以及任選的抗凝劑組成。

抗凝劑通常可以是肝素和/或EDTA。由于EDTA更適合中國專利第201610027214號所述的流式細胞檢測，因此優選在本發明第一方面的細胞保存液中，抗凝劑是EDTA或其鹽，如鉀鹽(即EDTA-K2)。

優選在本發明第一方面的細胞保存液中，每種組分的含量如下：Na2HPO4 10mmol/L、KH2PO4 2mmol/L、NaCl 137mmol/L、KCl 2.7mmol/L、聚乙二醇10-20％(wt)、氯化鉻0.1％-1％(wt)。如果本發明第一方面的細胞保存液包括抗凝劑，則優選其中，細胞保存液中抗凝劑的含量為15～22g/L。

本發明的細胞保存液沒有腐蝕性，也沒有氧化性，可以裝于多種材質的容器，如玻璃容器或塑料容器。

在第二方面，本發明提供了本發明第一方面的細胞保存液的制備方法，其包括將Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、聚乙二醇和氯化鉻以及任選的抗凝劑混合的步驟。

優選本發明第二方面的制備方法還包括混合后進行過濾和/或分裝的步驟。對于不加抗凝劑的細胞保存液來說，通常可以不分裝，直接裝于大試劑瓶中儲存；對于加抗凝劑的細胞保存液來說，優選進行分裝，這樣可以直接加入采集的含細胞的樣本而進行保存。分裝可以分裝在非真空管中，也可以分裝在真空管中。鑒于通常血液樣本的采集體積為1～2ml，因此分裝的體積對應為100～300μl/管，優選為200μl/管。

在第三方面，本發明提供了保存含有細胞的樣本的方法，其包括：

(1)提供含有細胞的樣本液；