[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610767902.7
• 申請(qǐng)日: 2016-08-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106967708B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董玉瑋;高明俠;王陶;張傳麗
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 徐州工程學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N11/14
• 分類(lèi)號(hào): C12N11/14;C12N11/10;C12N11/084;C12N11/04;C12R1/645
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本發(fā)明公開(kāi)了一種利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法，包括以下步驟：采用海藻酸鈉與活性炭固定化漢遜德巴利酵母；采用聚乙烯醇與海藻酸鈉二次固定化漢遜德巴利酵母；將二次固定化后漢遜德巴利酵母置于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明制備方法新穎、簡(jiǎn)便，操作程序易于控制，產(chǎn)量高，客服了傳統(tǒng)菌種產(chǎn)3?羥基丙酸產(chǎn)量低的缺點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種固定化漢遜德巴利酵母的方法，具體涉及一種利用復(fù)合材 料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法。

背景技術(shù)

3-羥基丙酸在工業(yè)上主要作為化學(xué)中間體，可以合成乙烯基氰、丙烯酸甲 酯、丙烯酸乙酯、1，3-丙二醇和丙二酸等，它還是新型綠色環(huán)保材料聚3-羥 基丙酸的重要原料。除此之外，3-羥基丙酸在生產(chǎn)特殊涂料、金屬潤(rùn)滑劑、紡 織業(yè)上的抗靜電劑及食品、飼料添加劑和保鮮劑等行業(yè)都有廣泛應(yīng)用。

目前化學(xué)方法生產(chǎn)3-羥基丙酸由于對(duì)環(huán)境污染危害較大，已經(jīng)逐步被生 物合成法所替代。然而生物合成法生產(chǎn)3-羥基丙酸普遍存在產(chǎn)量低的弊端， 導(dǎo)致供需之間的不平衡。細(xì)胞固定化技術(shù)是通過(guò)化學(xué)或者物理的方法將細(xì)胞或 者細(xì)胞產(chǎn)生的游離酶固定在與之對(duì)應(yīng)載體上，用以催化細(xì)胞增殖及生化反應(yīng)的 技術(shù)。固定化細(xì)胞技術(shù)具有良好的穩(wěn)定性能、簡(jiǎn)單方便的操作、產(chǎn)物易于分離、 生產(chǎn)效率高、可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。但是固定化細(xì)胞技術(shù)還有很多問(wèn)題 有待解決，比如固定化方式、尋找耐受性強(qiáng)的包埋材料、提高產(chǎn)物產(chǎn)量等。目 前利用固定化細(xì)胞制備3-羥基丙酸需要解決的主要問(wèn)題是如何提高產(chǎn)量與載 體的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利 酵母的方法，固定化后載體穩(wěn)定，并且提高了3-羥基丙酸的產(chǎn)量，適合產(chǎn)業(yè) 化推廣。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種利用復(fù)合材料二次固定化漢遜德巴利酵母的方法，包括以下步驟：

S1、將漢遜德巴利酵母依次經(jīng)種子斜面培養(yǎng)基活化、發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后， 通過(guò)無(wú)菌紗布過(guò)濾分離漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種和發(fā)酵培養(yǎng)基，得漢遜德 巴利酵母液體發(fā)酵菌種液；

S2、將海藻酸鈉、活性炭的混合物與所得的漢遜德巴利酵母液體發(fā)酵菌種 與按照0.5∶1-1∶1(w/v)比例混合，得混合液；其中，海藻酸鈉終濃度為 25-35g/L，活性炭終濃度為8-10g/L；

S3、用注射器吸取混合液滴入濃度為19-21g/L的CaCl₂溶液內(nèi)，，室溫固 定1-3h，得直徑0.3-0.5cm的固定化漢遜德巴利酵母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分 離小球后無(wú)菌水清洗2次；

S4、按照2-3個(gè)小球/mg過(guò)濾后的菌種的標(biāo)準(zhǔn)，將步驟S3所得的漢遜德 巴利酵母小球與過(guò)濾分離后的上述S1步驟的液體發(fā)酵菌種混合，再加入聚乙 烯醇和海藻酸鈉并混勻，聚乙烯醇終濃度為80-100g/L，海藻酸鈉終濃度在 9-11g/L；用直徑0.8cm吸管吸取混合液滴入濃度為9-11g/L的CaCl₂溶液內(nèi)， 室溫固定1-3h，4℃冰箱固定1-3h，得直徑0.8-1.2cm的固定化漢遜德巴利酵 母小球，無(wú)菌紗布過(guò)濾分離小球后無(wú)菌水清洗2次；

S5、將步驟S4所得的漢遜德巴利酵母小球加入到80-120ml液體發(fā)酵培養(yǎng) 基/250ml錐形瓶培養(yǎng)，28-32℃，在轉(zhuǎn)速為220-280r/min的恒溫振蕩箱中培 養(yǎng)48-72h。

優(yōu)選地，第一次固定化后漢遜德巴利酵母小球直徑為0.3cm，第二次固定 化后漢遜德巴利酵母小球直徑為1.2cm。

優(yōu)選地，所述步驟S2中海藻酸鈉、活性炭混合物中海藻酸鈉溶液/活性炭 ＝1∶1(w/v)。

優(yōu)選地，所述步驟S4中聚乙烯醇、海藻酸鈉混合物中聚乙烯醇/海藻酸鈉 溶液＝2∶1(w/v)。