[發(fā)明專利]一種含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610767493.0
• 申請(qǐng)日: 2016-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN107779435A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何躍;麥志國(guó);肖秀麗;袁靜娜;何炳坤;李維維;李結(jié)珍;來從顯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州市金航生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11411
• 代理人: 張清彥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，特別涉及一種含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

免疫細(xì)胞生物學(xué)和免疫分子生物學(xué)的進(jìn)展，推進(jìn)了免疫學(xué)在腫瘤治療中的應(yīng)用?，F(xiàn)今，腫瘤免疫治療已成為腫瘤治療的基本手段之一，其中細(xì)胞介導(dǎo)的過繼免疫治療為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。通過給腫瘤患者輸入特異性的或非特異性的具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或在患者體內(nèi)誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，達(dá)到抑制和治療腫瘤的目的。目前有關(guān)腫瘤免疫效應(yīng)細(xì)胞的研究和臨床的初步資料提示，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine induced killer,自體CIK)細(xì)胞是一種新型、高效的具有廣譜殺瘤活力的MHC非限制性的免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有增殖速度快、殺傷活性高、臨床應(yīng)用副作用小等優(yōu)點(diǎn)，是目前發(fā)現(xiàn)的殺瘤活性最強(qiáng)的免疫效應(yīng)細(xì)胞之一，在腫瘤免疫治療中顯露巨大應(yīng)用價(jià)值。

自體CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生一系列的因子并分泌于培養(yǎng)上清液中，這些細(xì)胞因子通過直接或間接的方式作用于腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤活性。IL-6是迄今為止發(fā)現(xiàn)的功能最為廣泛的細(xì)胞因子之一，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、血細(xì)胞的生成及多種細(xì)胞的增殖和分化。IFN-γ具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗細(xì)胞增強(qiáng)作用，對(duì)常規(guī)藥物治療無(wú)效的疾病或體質(zhì)較弱、免疫功能低下的病人，用本品治療或進(jìn)行輔助治療，往往可收到較好的效果。TNF-α是腫瘤壞死因子，它可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。GM-CSF是集落刺激因子中最重要的一種造血因子，對(duì)多系造血祖細(xì)胞如紅系、巨噬系、粒單系、嗜酸系等造血前體細(xì)胞都有刺激增殖和分化的作用，并能影響成熟髓系細(xì)胞的功能。在臨床上主要用于各種因素引起的白細(xì)胞減少癥、骨髓移植、再障、艾滋病等治療。

自體CIK細(xì)胞的培養(yǎng)上清液能夠有效地阻斷SARS病毒感染非洲綠猴腎源E6細(xì)胞，推測(cè)自體CIK細(xì)胞可能是在誘導(dǎo)和培養(yǎng)過程中表達(dá)了某些重要的細(xì)胞因子而抑制病毒的增殖和感染性，這為治療SARS疾病提示了一種可能途徑。自體CIK細(xì)胞的高效腫瘤抑制活性在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，但有關(guān)其細(xì)胞因子類別和表達(dá)水平的研究還未有系統(tǒng)報(bào)道。

自體CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生一系列的因子并分泌于培養(yǎng)上清液中，這些細(xì)胞因子通過直接或間接的方式作用于腫瘤細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤活性。至今多數(shù)研究?jī)H關(guān)注一種或少數(shù)幾種細(xì)胞因子的臨床作用，但已開始出現(xiàn)混合細(xì)胞因子的臨床應(yīng)用報(bào)導(dǎo)，他們采用PHA刺激人外周血單核細(xì)胞的方式來培養(yǎng)收獲上清液用于抗腫瘤應(yīng)用，該混合細(xì)胞因子可改變腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。

專利CN 101333515A公開了用D自體CIK細(xì)胞培養(yǎng)的上清液及其應(yīng)用，該技術(shù)方案通過下列方法制備得到的，該方法的具體步驟為：DC與自體CIK細(xì)胞混合誘導(dǎo)第9天后，D自體CIK細(xì)胞進(jìn)入大量擴(kuò)增制備的階段；當(dāng)培養(yǎng)液中的D自體CIK細(xì)胞濃度達(dá)到1～5×10⁶個(gè)/ml時(shí)，將混合均勻的D自體CIK細(xì)胞連同培養(yǎng)上清液一分為二，并另加入等體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；如此反復(fù)至第12-26天時(shí)，收集D自體CIK細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，該上清液提高抗腫瘤作用。

目前，將含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液制成細(xì)胞混懸液用于抗腫瘤作用還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的提供了含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液及其應(yīng)用，提高自體CIK細(xì)胞抗腫瘤作用更顯著。

本發(fā)明的目的將通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)：

一種含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液，其中，所述含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液由以下方法制備得到，所述具體方法為：(1)自體CIK細(xì)胞培養(yǎng)至第十四天，自體CIK細(xì)胞濃度達(dá)到1-5×10⁶個(gè)/ml，離心，分別得上清液1和底層細(xì)胞1；(2)所述底層細(xì)胞1加生理鹽水洗滌離心，得底層細(xì)胞2；(3)將步驟(1)所得的上清液1再經(jīng)過離心，棄底層絮狀沉淀，得上清液2；(4)向步驟(3)所述上清液2和步驟(2)所述底層細(xì)胞2混合，加入生理鹽水，人血白蛋白，硫酸慶大霉素，制成細(xì)胞混懸液，即得所述含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液。

上述的一種含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液，其中，所述方法還包括(1)包被抗人CD3單克隆抗體的培養(yǎng)瓶的預(yù)處理；(2)外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離提取與初培養(yǎng)；(3)自體CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)。

上述的一種含有自體CIK細(xì)胞的共培養(yǎng)上清液，其中，步驟(3)自體CIK細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)采用含有IL-2 1000U/ml，20％滅活血漿的RPMI-1640。