[發明專利]基于近紅外熒光探針銅納米簇的葉酸檢測方法

有效

• 申請號: 201610762476.8
• 申請日: 2016-08-29
• 公開（公告）號: CN107782704B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 李妍;李欣格;張菲
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 天津創智天誠知識產權代理事務所(普通合伙) 12214
• 代理人: 王秀奎

本發明公開基于近紅外熒光探針銅納米簇的葉酸檢測方法，通過綠色合成方法合成卵清蛋白包覆的近紅外熒光銅納米簇，銅納米簇作為熒光探針，葉酸作為熒光猝滅劑，由于銅納米簇與葉酸間的靜態猝滅作用，葉酸呈線性猝滅熒光探針銅納米簇熒光強度。本發明檢測葉酸的線性范圍為0.5?200μM，檢出限為0.2μM。使用的探針銅納米簇具有無毒、價格低廉、性能穩定、生物相容性等優點，檢測方法成本低廉、操作簡單、靈敏度高，具有巨大的潛在應用價值。

技術領域

本發明屬于生物分析檢測技術領域，涉及一種近紅外熒光探針銅納米簇的綠色合成方法對其及對生物小分子葉酸的檢測應用。

背景技術

葉酸，作為維生素B族的一種，是生命體內重要的底物和輔酶。缺少葉酸會誘發貧血、白血球減少癥、心智發展不足、精神病等等。然而，強化途徑攝入過量的葉酸會引起維生素B-12缺乏，進而增加老年人患神經性疾病的概率。所以，發展專一性好，靈敏度高，操作簡單的定量檢測方法具有重要的意義。目前葉酸的定量檢測方法主要有電化學法、高效液相色譜、流動注射化學發光法、分光光度計法和熒光方法。這些方法當中，以葉酸的電化學檢測容易收到維生素C的干擾，這是因為維生素C的氧化還原點位與葉酸的比較相近，氧化的維生素C容易附著在電極上影響葉酸的測定。此外，在大多數視頻當中維生素C的含量旺旺有遠大于也算的含量，這更干擾對葉酸的檢測。所以，開發更加簡單、具有高選擇性和靈敏度的葉酸探針十分重要。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供基于近紅外熒光探針銅納米簇的葉酸檢測方法，水溶的、無毒性的、熒光壽命長的、易儲存的、近紅外的熒光銅納米簇合成方法且在室溫下利用熒光強度變化對溶液中糖蛋白的操作簡單、反應快速、成本低廉、高靈敏度和高選擇性的檢測方法。

本發明的技術目的通過下述技術方案予以實現：

基于近紅外熒光探針銅納米簇的葉酸檢測方法，以磷酸緩沖水溶液(PBS)、銅納米簇分散體系和待測樣品組成葉酸檢測體系，檢測加入待測樣品前后的熒光強度變化，對比標準曲線，得到待測樣品中葉酸的含量，線性方程為F₀/F＝1.0589+0.0098C，F₀為不加入葉酸時的熒光強度檢測值，F為加入葉酸后的熒光強度檢測值，C為葉酸濃度。

上述檢測方法中，檢出限為0.20μM，檢測范圍為0.50-200μM。

上述檢測方法中，磷酸緩沖水溶液(PBS)濃度為0.01mol/L，25℃，pH＝7.4。

上述檢測方法中，磷酸緩沖水溶液3.1mL、銅納米簇分散體系0.8mL和待測樣品100μL組成葉酸檢測體系4.0mL。

銅納米簇分散體系，以卵清蛋白為保護劑，水合肼為還原劑的銅納米簇，按照下述步驟進行制備

步驟1，稱取60-160mg卵清蛋白溶解于裝有3-8mL高純水的燒杯中；

步驟2，向步驟1得到的溶液中加入0.02-0.18mL的0.1M氯化銅溶液，室溫條件下攪拌8-12min；

步驟3，向步驟2得到的溶液中加入0.1-1.5mL水合肼水溶液，其中水合肼的質量百分數為80％后，向其中加入高純水至8-20mL,并在室溫條件下攪拌2-5h后，即得到銅納米簇分散體系。

在制備后，使用截留分子量為6000-8000，直徑為25mm透析袋對步驟3制得銅納米簇進行純化，每3-5h換一次高純水，透析20-30h，待透析完成后將純化的銅納米簇在真空條件下30-40℃干燥后，得到在340nm光的激發下，發射在625nm近紅外熒光探針銅納米簇。

在步驟3中，水合肼的滴加速度為0.05-0.1mL/min，高純水的加入速度為0.5-1mL/s。

純化條件為每4h換一次高純水，透析24h，待透析完成后將純化的銅納米簇在真空條件下35℃干燥。