[發明專利]一種馬兜鈴的組織培養與植株再生的方法

在審

• 申請號: 201610759436.8
• 申請日: 2016-08-30
• 公開（公告）號: CN107771671A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 楊忠太
• 申請（專利權）人: 楊忠太
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種馬兜鈴的組織培養與植株再生的方法，具體地說是以一種馬兜鈴的組織培養與植株再生的方法。

背景技術

目前公知的馬兜鈴為馬兜鈴科馬兜鈴屬植物，它含一種具有腎毒性的物質馬兜鈴酸，同時這種物質也存在于許多有藥用價值的植物中。如果可以培育出不含馬兜鈴酸的新型植物，就可以發掘出馬兜鈴酸類中藥的潛在藥用價值，而更重要的是可將它作為改造其他有毒中藥的模式系統。在基因工程中可以通過基因敲除等技術去除有毒成分的合成基因或改變代謝途徑阻止有毒物質的合成。

發明內容

診斷標準：

研究對象：材料與方法；植物，馬兜鈴(Aristolochia contorta Bunge)來源于廣州中醫藥大學藥圃。取馬兜鈴嫩葉先用香皂水浸泡去污5～7min，然后自來水沖洗干凈；在超凈工作臺上，再用125mol/L的乙醇消毒30s，倒去乙醇，最后用005g/mL的升汞消毒10～18min，用無菌水沖洗8～10次。植物激素，糠氨基嘌呤(KT)為上海化學試劑公司產品；腺素(Ad)為上海麗珠東風生物技術有限公司產品；6芐氨基嘌呤(6BA)為新華活性材料研究所產品；α萘乙酸(NAA)為上海曹楊第二中學化工廠產品。培養基，基本培養基分別為1/2MS、MS和改良MS培養基(其中蔗糖改為20g/L，ＮaＨ２ＰＯ４為170mg/L)，試驗中根據具體要求在基本培養基中添加不同的植物激素，pH值為55～80。培養愈傷組織的誘導為暗培養，培養溫度為(25±1)℃；根以及芽的分化為每天光照16h，光照強度為3000lx(勒克斯)，培養溫度為(25±1)℃。結果；不同培養基對外植體誘導培養的影響在1/2MS培養基、MS培養基和改良MS培養基中同時分別加入01mg/LKT和02mg/LNAA，結果顯示在pH為75的環境下培養10d后，外植體在1/2MS培養基上未能誘導出愈傷組織，而在MS培養基和改良MS培養基上則能誘導出大量愈傷組織。

發明目的：馬兜鈴的組織培養獲得再生植株這一技術為在馬兜鈴酸類植物中進行基因改造提供必要的技術支持。以馬兜鈴嫩葉為外植體，誘導愈傷組織和叢生芽，基礎培養基的選擇以MS和改良MS培養基為好，在環境要求上pH＝70、pH＝80均可誘導較多的愈傷組織，而pH＝58只能誘導出少量，說明以堿性環境為好，與文獻認為培養植物材料大多數要求的堿性環境相似。

技術方案：以馬兜鈴葉片作為外植體，以１／２MS、MS和改良MS培養基為基本培養基，在這些基本培養基上分別添加相應的植物激素而成為誘導馬兜鈴愈傷組織的培養基，觀察：①3種基本培養基對誘導馬兜鈴愈傷組織的優劣；②不同pH值環境對誘導馬兜鈴愈傷組織的影響；③在相同的基本培養基中分別或同時加入不同種和不同量的植物激素(包括細胞分裂素KT或6BA和生長激素NAA)后，對誘導馬兜鈴愈傷組織的影響。以MS或改良MS為基本培養基，并在此基礎上添加1mg/L的KT和05mg/L的NAA組成誘導愈傷組織的培養基，在pH=70～80的堿性環境下培養，是馬兜鈴經組織培養能較好地誘導愈傷組織的條件。

發明有益效果：以MS或改良MS為基本培養基，并在此基礎上添加1mg/L的KT和05mg/L的NAA組成誘導愈傷組織的培養基，在pH=70～80的堿性環境下培養，是馬兜鈴經組織培養能較好地誘導愈傷組織的條件。

最佳實施方式：運用組織培養。

創新之處：本項發明專利涉及一種馬兜鈴的組織培養與植株再生的方法，在培養基中單純添加細胞分裂素則未能誘導出愈傷組織，而單純添加生長激素NAA則可誘導，說明在愈傷組織的誘導中，細胞生長素NAA起到很大的作用，主要是因為它能促進細胞生長、細胞分裂和誘導受傷的組織表面一至數層細胞恢復分裂能力。通常使用較高濃度的生長素，以誘導脫分化和促進愈傷組織生長［４］。本研究還顯示在改良MS培養基基礎上添加1mg/LKT和05mg/LNAA的培養基誘導效果最好。在誘導的第13天轉到添加1mg/LKT+002mg/LNAA+2mg/LAd的培養基中，則5d后可分化出根狀莖，再過5d即可由根狀莖長出芽。在添加03～1mg/LKT、02mg/LNAA和2mg/LAd的培養基中，叢生芽的增殖效果最好。