[發明專利]一種重組長效雞干擾素α的制備方法

有效

• 申請號: 201610756022.X
• 申請日: 2016-08-29
• 公開（公告）號: CN106282216B
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 趙雨;李樹啟;馬騰飛;符修樂;戚仕梅;高耀輝;賴鵬飛;王利利;汪良青;周煒
• 申請（專利權）人: 蕪湖英特菲爾生物制品產業研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C07K14/56;C12R1/19
• 代理公司: 蕪湖思誠知識產權代理有限公司 34138
• 代理人: 楊濤

1.一種重組長效雞干擾素α的制備方法，其特征在于所述的方法由下列步驟組成：(1)長效雞干擾素α基因的獲取，所述長效雞干擾素α基因的核苷酸序列如SeqIDNO.3所示；(2)所述長效雞干擾素α基因連接至原核表達載體pET-28a上獲得表達載體；(3)所述表達載體轉化大腸桿菌，獲得基因工程菌；(4)所述基因工程菌用IPTG誘導，表達長效雞干擾素α；(5)重組長效雞干擾素α粗制品的制備；(6)重組長效雞干擾素α粗制品的純化；

所述長效雞干擾素α基因的獲取步驟為：利用引物，從雞肝臟組織中提取RNA進行RT-PCR反應，并將擴增出的雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因通過柔性link連接起來；所述雞干擾素α基因的核苷酸序列如SeqIDNO.1所示；所述雞血清白蛋白基因的核苷酸序列如SeqIDNO.2所示；

所述雞干擾素α基因的引物序列為：上游：GAATTCCCCACCATGGCTGTGC下游：GGCGGCGGCGGCTCCAGTGCGCGTGTTGCCTGTGAGG上游引物帶有EcoRI酶切位點；下游引物帶有linker；所述雞血清白蛋白基因的引物序列：上游：CCGCCGCCGCCGATGAAGTGGGTAAC下游：CCATGGTTAAGCACCAATTCCTAATGTGGCTCTGCTTTGG上游引物帶有linker；下游引物帶有NcoI酶切位點；

所述RT-PCR反應的反應體系為：在25μL的總反應體系中，模板RNA1.5μL，上下游引物各0.5μL，反轉錄酶2.5μL，dNTPMix為10μL，加RNaseFree水至25μL；所述RT-PCR反應的反應條件為：50℃反轉錄30min，95℃預變性4min；94℃變性45S，58℃退火45S，72℃延伸1min，循環35次，最后72℃延伸10min；

所述雞干擾素α基因及雞血清白蛋白基因連接PCR反應體系為：在25μL的總反應體系中，雞干擾素模板DNA1μL、雞血清白蛋白模板DNA1μL，雞干擾素上游引物0.5μL，雞血清白蛋白下游引物0.5μL，轉錄酶2.5μL，dNTPMix為10μL，加RNaseFree水至25μL；連接PCR反應條件為：95℃預變性4min；94℃變性45S，58℃退火45S，72℃延伸90S，循環35次，最后72℃延伸10min；

所述大腸桿菌為BL21大腸桿菌；

所述重組長效雞干擾素α粗制品制備的步驟為：離心收集細菌，加入質量體積比1:1的PBS重懸沉淀，-20℃與室溫反復凍融沉淀3次，4℃超聲裂解細菌沉淀，超聲功率:400W，工作10s，間隔3S，超聲6min，重復3～4次，4℃離心，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制蛋白。

2.根據權利要求1所述一種重組長效雞干擾素α的制備方法，其特征在于：所述重組長效雞干擾素α粗制品純化的步驟為：親和層析、脫鹽、緩沖液置換、離子交換層析和分子篩層析。

3.如權利要求1所述一種重組長效雞干擾素α的制備方法構建的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌可以表達長效雞干擾素α。

4.如權利要求1所述一種重組長效雞干擾素α的制備方法制備的重組長效雞干擾素α。