[發明專利]一種農桿菌介導的黑附球菌遺傳轉化方法及轉化子菌株

在審

• 申請號: 201610746239.2
• 申請日: 2016-08-29
• 公開（公告）號: CN107779411A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 張雷剛;李鵬霞;胡花麗;羅淑芬;周宏勝;李志強
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/80;A01N63/04;A01P3/00;C12R1/645
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司32206
• 代理人: 杜靜

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用潮霉素為篩選標記的農桿菌介導的黑附球菌遺傳轉化方法，及產生的轉化子菌株。

背景介紹

目前，我國每年約有8000萬噸的果蔬腐爛，造成近800億元的經濟損失。因此，通過發展貯藏或防腐技術以延長或保持果蔬品質，已成為重要的食品研究課題。利用生防菌對病原菌的拮抗作用控制果蔬采后病害，具有綠色和安全的優點，是當前果蔬儲藏與保鮮行業的研究熱點。

黑附球菌（Epicoccumnigrum）H5菌株是由本研究團隊篩選的一株生防真菌，其次級代謝產物對鐮刀屬（Fusarium. spp）、灰霉屬（Botrytis cinerea）及鏈格孢屬（Alternaria. spp）等果蔬采后常見病原真菌有較強拮抗作用，該菌株已于2014年10月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（保藏登記號CGMCC 9713）。黑附球菌H5能夠在植物組織表面迅速產生抗真菌的化合物，顯著控制采后真菌病害的發生，因此是一種防治農作物病害較為理想的生防菌。生防菌次級代謝產物對病原菌有強烈的抑制作用，但大多數野生型生防菌株生活力一般，在發酵液中累積目的發酵產物的能力很差，同時還會形成很多影響防效的副產物。因此，通過基因工程技術提高活性成分產量、減少副產物產生，從而提高其生防效果對于實際應用具有重要意義。但目前尚未建立黑附球菌的遺傳轉化體系，無法對其進行基因改造。

發明內容

本發明目的在于填補目前黑附球菌遺傳轉化方法的技術空白，提供一套完整的農桿菌介導的原生質體制備及遺傳轉化的方法，并提供一株制備的轉化子菌株H5-5，該菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101，分類命名為黑附球菌（Epicoccum nigrum），菌種保藏編號為CGMCC NO.12874，保藏日期為2016年8月22日。轉化子菌株H5-5可用于防治果蔬采后病害，所述采后病害包括但不限于由鐮刀菌鐮刀屬（Fusarium. spp）、灰霉屬（Botrytis cinerea）等真菌引起的果蔬灰霉病、腐敗病等，如番茄灰霉病、蓮蓬腐爛病、辣椒灰霉病等。

本發明提供的轉化子菌株H5-5的主要生物學特征為：在PDA培養基上生長時有氣生菌絲，菌落呈土黃色，邊緣不規則，有V形分支；分生孢子單生，球形或梨形，一般多胞，深金黃褐色，老熟后顏色變深，通常成熟孢子直徑15～25μm，有時可達50μm。

本發明提供的農桿菌介導的黑附球菌遺傳轉化方法利用潮霉素抗性基因Hph為篩選標記，包括以下步驟：1) 黑附球菌原生質體的制備；2) 農桿菌的轉化和培養；3)遺傳轉化體系的建立；4)轉化子驗證與轉化效率分析；5)遺傳穩定性測定。

進一步的，具體包括以下步驟：

1）菌株、質粒、培養基

黑附球菌（Epicoccum nigrum）野生菌株H5，已于2014年10月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 9713；

pKHt質粒帶有潮霉素B磷酸轉移酶基因（Hph），Hph作為隨機插入突變體的篩選標記基因；

2）原生質體制備

a) 從黑附球菌H5試管斜面挑取菌絲，接種至PDA平板，25℃培養5天后在其邊緣打孔，接種于PD液體培養基，170 rpm、25℃搖培3天，過濾收集菌絲，用無菌濾紙吸干；

b) 用20 mL 0.6 mol/L甘露醇溶液配制的1%～2%的裂解酶懸浮菌絲體，30℃、80 rpm酶解1～3 h；

c) 4層滅菌擦鏡紙過濾，用0.6 mol/L甘露醇沖洗，收集濾液，1500 rpm離心5 min；

d) MMC緩沖液重懸，洗2 次；

e) 棄上清，用MMC緩沖液將原生質體沉淀重懸，并以MMC:PTC=3:1的比例加PTC緩沖液稀釋，調原生質體終濃度至3×10⁷～3×10⁸ 個/mL，冰上放置待用；

3）原生質體對潮霉素抗性濃度的篩選

a) 融化PDA培養基，待溫度降為 50℃左右時，加入一定體積的潮霉素溶液制備含潮霉素的平板，終濃度分別為 0、10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL，冷卻備用；