[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑附球菌遺傳轉(zhuǎn)化方法及轉(zhuǎn)化子菌株在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610746239.2 | 申請日： | 2016-08-29 |
| 公開（公告）號： | CN107779411A | 公開（公告）日： | 2018-03-09 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張雷剛;李鵬霞;胡花麗;羅淑芬;周宏勝;李志強 | 申請（專利權(quán)）人： | 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 |
| 主分類號： | C12N1/15 | 分類號： | C12N1/15;C12N15/80;A01N63/04;A01P3/00;C12R1/645 |
| 代理公司： | 南京眾聯(lián)專利代理有限公司32206 | 代理人： | 杜靜 |
| 地址： | 210014 江蘇省南京市玄*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 桿菌 球菌 遺傳 轉(zhuǎn)化 方法 菌株 | ||
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑附球菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
1）菌株、質(zhì)粒
a) 黑附球菌野生菌株H5，已于2014年10月8日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 9713；
b) pKHt質(zhì)粒帶有潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 Hph，Hph 作為隨機插入突變體的篩選標(biāo)記基因；
2）原生質(zhì)體制備
a) 從黑附球菌H5試管斜面挑取菌絲，接種至PDA平板，25℃培養(yǎng)5天后在其邊緣打孔，接種于PD液體培養(yǎng)基，170 rpm、25℃搖培3天，過濾收集菌絲，用無菌濾紙吸干；
b) 用20 mL 0.6 mol/L甘露醇溶液配制的1%～2%的裂解酶懸浮菌絲體，30℃、80 rpm酶解3 h；
c) 4層滅菌擦鏡紙過濾，用0.6 mol/L甘露醇沖洗，收集濾液，1500 rpm離心5 min；
d) MMC緩沖液重懸，洗2次；
e) 棄上清，用MMC緩沖液將原生質(zhì)體沉淀重懸，并以MMC:PTC=3:1的比例加PTC緩沖液稀釋，調(diào)原生質(zhì)體終濃度至3×107～3×108 個/mL，冰上放置待用；
3）原生質(zhì)體對潮霉素抗性濃度的篩選
a) 融化PDA培養(yǎng)基，待溫度降為50℃左右時，加入一定體積的潮霉素溶液制備含潮霉素的平板，終濃度分別為 0、10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL，冷卻備用；
b) 用無菌玻璃棒將步驟2）制備好的原生質(zhì)體懸液輕輕涂布在含不同濃度潮霉素的PDA平板表面，25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)；
c) 每天觀察并記錄原生質(zhì)體的再生情況；
4）農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)
a) 采用凍融法將質(zhì)粒pKHt轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL-1；
b) 將含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌在含50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL利福平的LB平板上劃線，挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中, 180 rpm、28℃過夜培養(yǎng)至OD600 0.5～0.8，離心，MES溶液重懸，50 rpm搖培1～3 h；
5）黑附球菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化
a) 將制備好的農(nóng)桿菌和原生質(zhì)體按照1:1～100:1比例混合，均勻涂在鋪有纖維素尼龍膜的IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～72 h；
b) 待膜上長出小菌絲，將膜轉(zhuǎn)移至含25、50、100、150 μg/mL潮霉素和300 μg/mL頭孢霉素的PDA平板；
e) 待轉(zhuǎn)化子長成菌落，轉(zhuǎn)接到含藥平板上，進行下一步驗證；
6）轉(zhuǎn)化子驗證
a) 利用CTAB法從步驟5）取得的轉(zhuǎn)化子中提取DNA，以 Hph 基因全長擴增引物hygbF/hygbR驗證轉(zhuǎn)化子；
b) 以引物ProbF/ProbR擴增504 bp的 Hph 基因片段作為探針，采用Roche公司地高辛標(biāo)記試劑盒進行Southern雜交驗證；
7）轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性分析
a) 隨機挑選20個抗潮霉素轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接到含50 μg/mL潮霉素的PDA平板上，25℃培養(yǎng)3天；
b)從菌落邊緣挑取菌碟到新的PDA平板上，重復(fù)上述培養(yǎng)過程4次，最后一輪轉(zhuǎn)接后挑取菌碟接到含50 μg/mL潮霉素的PDA平板上，25℃培養(yǎng)，若能生長則說明該轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，反之則表明該菌株不具有遺傳穩(wěn)定性；以黑附球菌野生型菌株H5為對照。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的轉(zhuǎn)化子菌株 H5-5，其菌種保藏編號為CGMCC NO.12874。
3.權(quán)利要求2所述的菌株 H5-5在防治果蔬采后病害中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，所述的采后病害為由鐮刀菌（Fusarium sp.）、灰霉菌（Botrytis sp.）等真菌引起的果蔬灰霉病、腐敗病等。
5.如權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述的采后病害為番茄灰霉病、蓮蓬腐爛病、辣椒灰霉病等。
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