[發明專利]一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗鑒定的方法

有效

• 申請號: 201610740314.4
• 申請日: 2016-08-26
• 公開（公告）號: CN106399475B
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 姚輝;馬雙姣;陳士林;宋經元;楊兵勛;楊培;周紅
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所;浙江天皇藥業有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12N15/10
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

本發明公開了一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法，提供了用于鐵皮楓斗鑒定的標準序列，可有效解決鐵皮楓斗藥材分子鑒定問題。具體步驟如下：(1)設計兩對引物對ITS2序列分段進行PCR擴增；(2)對擴增結果測序后，按重疊區域連接在一起，獲得ITS2序列；(3)與本發明標準序列SEQ ID No.1比對，序列相似性大于或等于99％，則鑒定為鐵皮石斛。本發明能夠實現鐵皮楓斗藥材、基原植物、種子種苗等的快速、準確鑒定。

技術領域

本發明涉及術語中藥材來源品種鑒定技術領域，具體涉及利用核糖體DNA(rDNA)ITS2片段快速鑒別鐵皮楓斗的方法及其應用。

背景技術

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(《中國植物志》英文版eflora中拉丁名為Dendrobium catenatum Lindley)為蘭科珍稀名貴藥用植物，有“中華九大仙草之首”之盛名。鐵皮石斛對生長環境條件要求苛刻，其自然繁殖能力低，生長緩慢，又經長期采挖，自然資源瀕臨枯竭，被列為國家重點保護的藥材品種。鐵皮楓斗是由鐵皮石斛鮮條加工而成，已被公認為高端養生品。目前，我國藥用石斛約有40余種，近年來鐵皮石斛價格不斷攀升，市場上把石斛屬其他植物或蘭科某些植物也作為鐵皮石斛混入商品流通和臨床應用，對鐵皮石斛的臨床療效和用藥安全產生了很多不良影響。DNA條形碼技術依賴樣品自身的基因分子信息，能夠實現物種的準確鑒定。目前該技術在鐵皮楓斗的鑒定中有以下問題：(1)鐵皮石斛加工成鐵皮楓斗的過程中，多進行高溫加熱進行加工，且時間較長，造成樣品DNA的嚴重降解，影響DNA的提取效率；(2)通用引物ITS2F/3R在鐵皮楓斗ITS2序列擴增中，擴增效率低。針對以上問題，本發明提供了一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法。

發明內容

本發明第一個目的在于提供獲取鐵皮楓斗rDNA ITS2序列的PCR擴增策略、PCR擴增特異引物和體系配比。

本發明第二個目的在于提供鑒別鐵皮楓斗的鑒定方法。

本發明提供的鐵皮楓斗rDNA ITS2序列制備方法主要包括如下步驟：

(1)擴增策略：由于鐵皮楓斗DNA降解較嚴重，故對鐵皮楓斗ITS2序列進行分段擴增，即設計兩對引物DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R分別擴增更短的序列，保證擴增的成功率，將DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R獲得序列按重疊部分連接起來即得ITS2序列。

(2)PCR擴增特異引物：

用于鐵皮楓斗ITS2序列分段擴增的引物為：

正向DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；

反向DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；

按以下程序擴增：95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，40個循環；72℃ 10min；

正向DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；

反向DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’；

按以下程序擴增：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，40個循環；72℃ 10min。

(3)PCR擴增體系配比：