[發明專利]一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗鑒定的方法

有效

• 申請號: 201610740314.4
• 申請日: 2016-08-26
• 公開（公告）號: CN106399475B
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 姚輝;馬雙姣;陳士林;宋經元;楊兵勛;楊培;周紅
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所;浙江天皇藥業有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6806;C12N15/10
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 崔自京

1.一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)樣品的DNA提取；

2)應用兩對引物對ITS2序列分段進行PCR擴增；

用于分段擴增ITS2序列的引物為：

正向DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；

反向DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；

正向DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；

反向DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’；

3)對分段擴增結果測序后，按重疊區域連接在一起，獲得ITS2序列；

4)與SEQ ID No.1所示序列比對分析進行鑒定。

2.根據權利要求1所述的一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法，其特征在于，所述樣品為鐵皮楓斗。

3.根據權利要求1所述的一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法，其特征在于，由于鐵皮楓斗藥材基因組DNA降解嚴重，提取的DNA濃度很低，需加大模板DNA的體積；PCR擴增體系25μL，包括2×TaqPCR Mix12.5μL，2.5μmol·L^-1的特異引物正反向各1.0μL，DNA模板溶液10.5μL。

4.根據權利要求1或權利要求2所述的一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法，其特征在于，所述的PCR擴增條件為：

引物DO-2F/DO-2R進行PCR擴增反應參數：95℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，40個循環；72℃10min；

引物DO-3F/DO-3R進行PCR擴增反應參數：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，40個循環；72℃10min。

5.根據權利要求1或權利要求2所述的一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法，其特征在于，用DNAMAN軟件對樣品的ITS2序列與SEQ ID No.1所示序列進行比對，序列相似性大于或等于99％，則鑒定為鐵皮楓斗。

6.權利要求1-5任一項所述一種獲取rDNA ITS2序列用來對鐵皮楓斗進行鑒定的方法在鑒別鐵皮楓斗及其基原植物、種子、種苗中的應用。