[發明專利]用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒及其構建方法和用途

有效

• 申請號: 201610740286.6
• 申請日: 2016-08-26
• 公開（公告）號: CN106282229B
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 朱慧蘭;李華平
• 申請（專利權）人: 廣州市皮膚病防治所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/66;C12Q1/02
• 代理公司: 44215 東莞市華南專利商標事務所有限公司
• 代理人: 劉克寬

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒及其構建方法和用途，其中所述重組質粒包含一個或兩個以上相互串聯的抗氧化反應元件以及基礎轉錄元件、分泌型熒光素酶基因、分泌型堿性磷酸酶基因。與現有技術相比，本發明采用分泌型熒光素酶作為報告基因，其檢測靈敏度高，檢測熒光素酶基因活性時無需裂解細胞，實現了抗氧化劑高通量的篩選和比較，以及長期效應的檢測，為篩選抗氧化劑或檢測抗氧化劑活性提供了一種高效、快速、簡便的方法，可應用于具有抗氧化作用天然藥物和人工合成的化合物的篩選。

技術領域

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒及其構建方法和用途。

背景技術

人體在受到多種環境因素如紫外照射等情況下，會產生活性氧族(reactiveoxygen species，ROS)。ROS作為第二信使，誘發炎癥反應、細胞膜脂質過氧化、蛋白和DNA氧化損傷，直接或間接地破壞細胞內蛋白質、脂質、核酸等大分子物質的生理功能，進而誘發包括細胞氧化應激損傷或凋亡，進一步導致腫瘤等的形成。當暴露于ROS時，機體自身能誘導一系列保護性蛋白，其中核因子NF-E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,簡稱Nrf2)信號通路是最為重要的抗氧化應激通路，它可以啟動II相酶和抗氧化酶等基因轉錄，維持體內氧化還原平衡，提高細胞抗氧化應激能力。但損害過量或由于年齡因素導致細胞內源性抗氧化能力下降，細胞中的ROS產生量超出細胞自身清除能力，則導致損傷。因此，采用抗氧化劑誘導II相酶和抗氧化酶等基因的表達和提高細胞內的抗氧化能力是探索安全有效且作用機制明確的抗氧化藥物和化妝品行業的重點。

如上所述，Nrf2信號通路是最重要的抗氧化應激通路，激活后的Nrf2，由胞漿轉移至胞核，與Maf蛋白形成異二聚體，識別并與核內抗氧化反應元件(antioxidant responseelement,ARE)結合，啟動II相酶和抗氧化酶基因轉錄，維持體內氧化還原平衡，提高細胞抗氧化應激能力。

目前已有報道利用ARE順式轉錄原件(cis-regulatory element)調控報告基因來監控Nrf2的轉錄激活作用，這些報告基因主要包括螢火蟲熒光素酶(Fireflyluciferase)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、綠色熒光蛋白(Green fluorescentprotein)、β-半乳糖甘酶(β-galactosidase)等。然而，這些報告系統還存在一系列的問題：(1)以螢火蟲熒光素酶等各種酶作為報告基因，后續檢測其活性時均需要裂解細胞后檢測，操作步驟復雜而不方便，難以實現長期檢測；(2)檢測靈敏度較差，還有待進一步提高；(3)上述報告基因采用瞬時轉染，其中最常用的HaCaT細胞其轉染效率非常低(轉染效率20％左右)，導致結果不穩定。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種簡便、快速、高效的用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒及其構建方法和用途，從而實現了對能否激活Nrf2通路的抗氧化劑進行高通量的篩選和比較，以及長期效應的檢測，而且檢測靈敏度可靠、穩定。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

提供用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒，所述重組質粒包含一個或兩個以上相互串聯的抗氧化反應元件以及基礎轉錄元件、分泌型熒光素酶基因、分泌型堿性磷酸酶基因；所述抗氧化反應元件為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

其中，所述基礎轉錄元件包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

其中，所述分泌型熒光素酶基因是源于Gaussia princeps的分泌型熒光素酶基因。

其中，所述源于Gaussia princeps的分泌型熒光素酶基因包含其野生型序列以及SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。