[發明專利]用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒及其構建方法和用途

有效

• 申請號: 201610740286.6
• 申請日: 2016-08-26
• 公開（公告）號: CN106282229B
• 公開（公告）日: 2020-01-17
• 發明（設計）人: 朱慧蘭;李華平
• 申請（專利權）人: 廣州市皮膚病防治所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12Q1/66;C12Q1/02
• 代理公司: 44215 東莞市華南專利商標事務所有限公司
• 代理人: 劉克寬

1.用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒，其特征在于：所述重組質粒包含1或2或4或8個相互串聯的抗氧化反應元件，以及基礎轉錄元件、分泌型熒光素酶基因和分泌型堿性磷酸酶基因；其中：

所述抗氧化反應元件為SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

1個抗氧化反應元件串聯后所對應的序列為SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；

2個抗氧化反應元件串聯后所對應的序列為SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；

4個抗氧化反應元件串聯后所對應的序列為SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；

8個抗氧化反應元件串聯后所對應的序列為SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；

所述分泌型熒光素酶基因是源于Gaussia princeps的分泌型熒光素酶基因；所述源于Gaussia princeps的分泌型熒光素酶基因為其野生型序列或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列或編碼SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述分泌型堿性磷酸酶基因為SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列或編碼SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

所述基礎轉錄元件為SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

所述重組質粒還包含有抗性基因。

2.根據權利要求1所述的用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒，其特征在于：所述抗性基因選自新霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。

3.如權利要求1或2所述的用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)在含有分泌型熒光素酶基因和含有CMV啟動子序列的分泌型堿性磷酸酶質粒中，將基礎轉錄元件通過分子克隆技術構建到分泌型熒光素酶基因的上游；

(2)通過分子克隆技術將一個或兩個以上相互串聯的抗氧化反應元件構建到步驟(1)獲得的質粒的基礎轉錄元件的上游，從而獲得重組質粒；

(3)將步驟(2)獲得的重組質粒轉染至體外培養的細胞中，然后加入含有TBHQ或者SF培養基，對細胞刺激誘導，繼續培養2-24h后，取出培養基上清，然后加入熒光素酶檢測試劑，檢測熒光素酶活性，選出對TBHQ或者SF誘導響應最高的質粒即為所述用于篩選Nrf2激活劑的重組質粒。

4.如權利要求1或2所述的重組質粒在篩選抗氧化劑中的應用。

5.采用權利要求1或2所述的重組質粒篩選抗氧化劑的方法，包括以下步驟：

(1)將所述重組質粒轉染到細胞，然后加入待篩選的藥物，繼續培養2-24h；

(2)取出培養基上清，加入熒光素酶檢測試劑反應5～15min，然后檢測熒光素酶的相對活性，若隨待篩選的藥物濃度增加，熒光素酶的相對活性也增加，則判定該藥物具有抗氧化活性。