[發(fā)明專利]一種溶血栓藥物rPA新的生產(chǎn)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610735777.1
• 申請日: 2016-08-26
• 公開（公告）號: CN107779467A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉建明
• 申請（專利權(quán)）人: 葉建明
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N9/64;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種溶血栓藥物rPA新的生產(chǎn)方法

背景技術(shù)

心血管疾病引發(fā)的血栓并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類生命，是導(dǎo)致死亡和病殘的主要疾病之一。由血栓造成的急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)的死亡率可高達(dá)30％，中國每年約350萬人死于各類心血管病，占總死亡原因之首，平均每十秒鐘就死一個(gè)患者。一半以上的人首次發(fā)作就是心肌梗死或者猝死，美國每年約有150萬人發(fā)生心肌梗死。靜脈溶栓治療是AMI治療的最重要進(jìn)展，是治療急性心肌梗塞，減少死亡率的主要方法。

溶栓藥物發(fā)展經(jīng)歷從非特異性溶栓藥到特異性溶栓藥，從靜脈持續(xù)滴注藥物到靜脈注射藥物。第一代溶栓藥物以鏈激酶和尿激酶為代表，此類藥物缺乏溶栓特異性，對全身纖溶系統(tǒng)的影響很大，導(dǎo)致出血并發(fā)癥比率高，同時(shí)再通率低。人內(nèi)源性組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasmniogen actviator，tPA)是纖溶酶原家族的一個(gè)多區(qū)域的絲氨酸蛋白酶。早在1980年，就已發(fā)現(xiàn)tPA可以引起纖維蛋白誘導(dǎo)的血栓裂解及可以作為治療如AMI等急性血栓的溶栓劑。第二代溶栓藥物即以重組表達(dá)的tPA(阿替普酶，rt-PA)為代表，此類藥物具有一定的溶栓特異性，但半衰期短，給藥方式復(fù)雜，需要先一次靜推，再兩次靜滴，而且需要根據(jù)體重調(diào)節(jié)劑量。

第三代溶栓藥物rPA(Reteplase)是組織型纖溶酶原激活劑(tPA)的區(qū)域缺失性突變體，由德國Boehringer Mannheim公司開發(fā)，1996年FDA批準(zhǔn)上市，商品名Retavase，是一個(gè)分子量為39.6KD的單鏈非糖基化多膚，為E.coli表達(dá)的非活性包涵體經(jīng)體外復(fù)性加工而得到，此突變體含9對二硫鍵，復(fù)性難度很大，復(fù)性產(chǎn)率低(5％以下)，上述原因使得rPA價(jià)格不菲，在國內(nèi)市場仍難以普及。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)新的rPA制備方法，以降低rPA成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種溶血栓藥物rPA新的生產(chǎn)方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備溶血栓藥物rPA的方法，所述方法包括步驟：

a)利用酵母菌分泌表達(dá)rPA，篩選獲得高表達(dá)菌株；

b)利用酵母菌分泌表達(dá)配體刺桐胰蛋白酶抑制劑(ETI)，篩選獲得高表達(dá)菌株；

c)利用ETI作為配體與固定相偶聯(lián)制備親和層析介質(zhì)；

d)利用步驟c)所得的親和層析介質(zhì)對步驟a)所得的rPA進(jìn)行親和層析，分離純化所述rPA。

優(yōu)選地，所述方法包括步驟：

(1)rPA高表達(dá)菌株的獲得：

將rPA核苷酸序列，兩端引入XhoI/NotI限制性酶切位點(diǎn)，插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母菌，篩選高表達(dá)菌株；

(2)ETI高表達(dá)菌株的獲得：

在ETI核苷酸序列的C末端引入組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，然后兩端引入XhoI/NotI限制性酶切位點(diǎn)，插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母菌株，篩選高表達(dá)菌株；

(3)ETI親和層析介質(zhì)的制備：

將上述ETI高表達(dá)菌株發(fā)酵或搖瓶表達(dá)的ETI經(jīng)固化金屬離子親和層析(IMAC)純化，然后和溴化氰活化的親和層析介質(zhì)混合，制作ETI親和層析柱；

(4)rPA純化：

上述rPA高表達(dá)菌株發(fā)酵或搖瓶表達(dá)產(chǎn)物先經(jīng)簡單離心或過濾，上清液過ETI親和層析柱，沖洗后洗脫，收集洗脫液，即得所述rPA。

優(yōu)選地，所述rPA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

優(yōu)選地，所述ETI核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

優(yōu)選地，所述親和層析介質(zhì)為Sepharose 4B。

優(yōu)選地，所述固化金屬離子親和層析柱為鎳柱。

優(yōu)選地，所述rPA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

優(yōu)選地，所述刺桐胰蛋白酶抑制劑(ETI)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優(yōu)選地，所述酵母為畢赤酵母菌株；優(yōu)選地，所述畢赤酵母菌株為GS115，SMD1168等。

更優(yōu)選地，所述酵母為畢赤酵母菌株GS115。