[發(fā)明專利]一種溶血栓藥物rPA新的生產(chǎn)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610735777.1
• 申請(qǐng)日: 2016-08-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107779467A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葉建明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 葉建明
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N9/64;C12R1/84
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種制備溶血栓藥物rPA的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

a)利用酵母菌分泌表達(dá)rPA，篩選獲得高表達(dá)菌株；

b)利用酵母菌分泌表達(dá)配體刺桐胰蛋白酶抑制劑(ETI)，篩選獲得高表達(dá)菌株；

c)利用ETI作為配體與固定相偶聯(lián)制備親和層析介質(zhì)；

d)利用步驟c)所得的親和層析介質(zhì)對(duì)步驟a)所得的rPA進(jìn)行親和層析，分離純化所述rPA。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步驟：

(1)rPA高表達(dá)菌株的獲得：

將rPA核苷酸序列，兩端引入XhoI/NotI限制性酶切位點(diǎn)，插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母菌，篩選高表達(dá)菌株；

(2)ETI高表達(dá)菌株的獲得：

在ETI核苷酸序列的C末端引入組氨酸標(biāo)簽(His-tag)，然后兩端引入XhoI/NotI限制性酶切位點(diǎn)，插入表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母菌株，篩選高表達(dá)菌株；

(3)ETI親和層析介質(zhì)的制備：

將上述ETI高表達(dá)菌株發(fā)酵或搖瓶表達(dá)的ETI經(jīng)固化金屬離子親和層析(Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC)純化，然后和溴化氰活化的親和層析介質(zhì)混合，制作ETI親和層析柱；

(4)rPA純化：

上述rPA高表達(dá)菌株發(fā)酵或搖瓶表達(dá)產(chǎn)物先經(jīng)簡(jiǎn)單離心或過(guò)濾，上清液過(guò)ETI親和層析柱，沖洗后洗脫，收集洗脫液，即得所述rPA。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述rPA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述刺桐胰蛋白酶抑制劑(ETI)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母為畢赤酵母菌株；優(yōu)選地，所述畢赤酵母菌株為GS115，SMD1168等。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為畢赤酵母分泌表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述畢赤酵母分泌表達(dá)載體為pPICZαA載體、pPICZαB、pPICZαC、或pPIC9K。