[發(fā)明專利]一種針對魚中生物胺的快速分析方法

有效

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• 申請日: 2016-08-25
• 公開（公告）號: CN107782834B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許國旺;傅燕青;趙春霞;路鑫;周智慧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種針對魚中生物胺的快速分析方法，其特征在于：

（1）將魚肉組織均質(zhì)化之后，采用5-磺基水楊酸作為提取溶劑，珠打研磨作為提取方法進行生物胺的提取；

（2）將提取后的樣品溶液進行稀釋之后，加入苯甲酰氯溶液進行衍生，衍生反應(yīng)在室溫條件下渦旋即可完成，待反應(yīng)結(jié)束后，離心，取上清液用于檢測分析；

（3）采用液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的多反應(yīng)監(jiān)測模式進行樣本分析；

（4）采用內(nèi)標(biāo)法對生物胺衍生物進行定量分析，獲得魚中生物胺的含量；

步驟（1）中將獲得的魚去皮剔骨除內(nèi)臟后放入料理機中進行粗均質(zhì)，粗均質(zhì)轉(zhuǎn)速為10000-20000轉(zhuǎn)/分，均質(zhì)時間為1-5 min；

實際樣品分析：稱取20 mg ± 0.5 mg粗均質(zhì)后的魚肉組織置于ep管中，依次加入氧化鋯小球，300 μL濃度為 5 mg/mL的5-磺基水楊酸溶液，100 μL濃度皆為4.5 μg/mL的1-庚胺和1,7-庚二胺內(nèi)標(biāo)溶液，100 μL體積濃度為20%的乙腈溶液，之后采用混合研磨儀在20-25Hz的條件下研磨提取1 min，重復(fù)2-4次，研磨提取后的樣品立即放入離心機中，在4-10^oC，14000-15000 rpm的條件下離心10-15 min，取離心之后的上清液100 μL置于ep管備用；

和/或，方法驗證中回收率、重復(fù)性以及日內(nèi)日間精密度考察：稱取20 mg ± 0.5 mg粗均質(zhì)后的魚肉組織置于ep管中，依次加入氧化鋯小球，300 μL濃度為 5 mg/mL的5-磺基水楊酸溶液，100 μL濃度皆為4.5 μg/mL的1-庚胺和1,7-庚二胺內(nèi)標(biāo)溶液，100 μL含9種生物胺的混標(biāo)溶液，濃度根據(jù)實驗需要而定，之后采用混合研磨儀在20-25 Hz的條件下研磨提取1 min，重復(fù)2-4次，研磨提取后的樣品立即放入離心機中，在4-10^oC，14000-15000 rpm的條件下離心10-15 min，取離心之后的上清液100 μL置于ep管備用；

步驟（1 ）中離心之后取的100 μL上清液加入900 μL濃度為50 mM的硼砂緩沖溶液，渦旋1-2 min之后取10 μL，依次加入45 μL濃度為100 mM的硼砂緩沖溶液和45 μL體積濃度為1%的苯甲酰氯乙腈溶液，渦旋10 min后置于離心機在4-10^oC，14000 -15000 rpm的條件下離心10-15 min，然后取上清液用于分析；

步驟（3）中采用液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的多反應(yīng)監(jiān)測模式進行樣本分析；

（a）液相色譜條件：Waters HSS T₃色譜柱 2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm；柱溫為60 ℃；流動相：A相為體積濃度0.1% FA（甲酸）的H₂O，B相為體積濃度0.1% FA的ACN（乙腈）；流速設(shè)置為0.2 mL/min；總的色譜運行時間為15 min；洗脫梯度為：0 ~ 1 min，2% B（V/V），1 ~ 4min，梯度從2% B（V/V）線性增至30% B（V/V），4 ~ 4.1 min，梯度從30% B（V/V）線性增至50%B（V/V），4.1 ~ 9 min，50% B（V/V），9 ~9.1 min，梯度從50% B（V/V）線性增至95% B（V/V），9.1 ~ 12 min，95% B（V/V），12 ~12.1 min，梯度從95% B（V/V）線性降至2% B（V/V），12.1 ~15 min，2% B（V/V）；色譜分析時，待分析的樣品以及流動相在前2 min通過六通閥切進廢液，2 ~ 12 min切進質(zhì)譜，12 ~ 15 min切進廢液；進樣室溫度為4^oC；進樣體積為2 μL~10 μL；

（b）質(zhì)譜條件：ESI源，霧化氣、加熱氣、干燥氣的流速分別為3、10、10 L/min；接口溫度、DL溫度、加熱氣溫度分別為300、250、400^oC；

所述生物胺為胍基丁胺，組胺，酪胺，精胺，亞精胺，2-苯乙胺，色胺，尸胺，腐胺。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟（3）中采用多反應(yīng)監(jiān)測模式分析樣本；優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測模式的方法，挑選響應(yīng)最高的離子對作為定量離子對，響應(yīng)次之的離子對作為輔助定性離子對。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟（4）中采用內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)線性定量曲線進行定量檢測分析。