[發明專利]固定化賴氨酸脫羧酶、其制備、1,5-戊二胺制備方法及產品

有效

• 申請號: 201610726632.5
• 申請日: 2016-08-25
• 公開（公告）號: CN107779446B
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 徐冠珠;于麗珺;劉修才
• 申請（專利權）人: 上海凱賽生物技術股份有限公司;CIBT美國公司;凱賽（太原）生物科技有限公司
• 主分類號: C12N11/12
• 分類號: C12N11/12;C12N11/084;C12P13/00
• 代理公司: 北京律智知識產權代理有限公司 11438
• 代理人: 于寶慶;王瑩

本發明涉及固定化賴氨酸脫羧酶、其制備、1,5?戊二胺制備方法及產品。具體涉及一種包括重氮基修飾的高分子載體和賴氨酸脫羧酶的固定化賴氨酸脫羧酶，及以重氮基修飾的高分子載體制備固定化賴氨酸脫羧酶的方法；及以固定化賴氨酸脫羧酶制備1,5?戊二胺的方法及其制得的1,5?戊二胺。該固定化方法對酶的固定化效率高，使用穩定性好，提高酶的使用效率，解決傳統工藝中游離態賴氨酸脫羧酶(細胞)使用穩定性差的問題，極大降低載體的使用成本和1,5?戊二胺生物法生產成本，簡化1,5?戊二胺溶液和酶的分離步驟，加大1,5?戊二胺生產的自動化程度，推進了生物法生產1,5?戊二胺的產業化進程。

技術領域

本發明涉及一種固定化賴氨酸脫羧酶及其制備方法以及1,5-戊二胺制備方法及得到的1,5-戊二胺；具體地，涉及一種包括重氮基修飾的高分子載體和賴氨酸脫羧酶的固定化賴氨酸脫羧酶，以及將高分子物質進行化學改造，得到重氮基修飾的高分子載體，并以此重氮基修飾的高分子載體制備固定化賴氨酸脫羧酶的方法。本發明還涉及以該固定化賴氨酸脫羧酶制備1,5-戊二胺的方法及其制得的1,5-戊二胺。

背景技術

生物催化反應具有條件溫和、選擇性高、反應效率高等特點，因而越來越多地應用于化學合成領域。但由于生物酶在體外工業環境下的穩定性差以及酶制劑的成本過高等缺陷，極大地限制了生物催化在工業領域的實際應用。

固定化酶技術通過將酶分子束縛(或結合)于水不溶性載體上，不僅有效解決了催化劑的重復使用問題，還可顯著改善生物酶的穩定性及催化特性(底物親和力、立體選擇性等)。目前，固定化酶研究內容廣泛，研究表明：載體的合成、表征、幾何參數、表面活性及理化性質等，對于酶的固載量、酶活回收率和穩定性等方面，有很重要的影響。現在，工業上已成功固定化并應用的酶只有青霉素酰化酶、葡萄糖異構酶等。

1,5-二氨基戊烷(又稱1,5-戊二胺，簡稱戊二胺)是化學工業中重要的C5化合物，主要用途是制造聚酰胺、聚氨酯、異氰酸酯、吡啶、哌啶等重要化工原料。迄今為止，工業上二胺類物質主要由石油基原材料經二羧酸中間體或者通過氨基酸的化學脫羧作用進行化學生產(Albrecht，Klaus等人；Plastics；Winnacker-Kuechler(第5版)(2005))。隨著生物技術的發展，人類可以利用生物法合成1,5-戊二胺，主要是通過微生物自身或者外源過量表達的賴氨酸脫羧酶催化底物賴氨酸脫羧，得到1,5-戊二胺，以下文獻和專利中對此進行了描述：Tabor,Herbert,etal；Journal of bacteriology(1980),144(3),952-956、JP2002-223770、JP2008104453A、CN200810005332、JP2002-223771A、JP2004-000114A、EP1482055B1、JP2005-060447A、CN101578256A、CN102056889A、CN102782146A等。

目前，以生物法生產的賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧，生產1,5-戊二胺的工藝中，通常使用游離狀態的賴氨酸脫羧酶或賴氨酸脫羧酶細胞，或者使用可同時生產賴氨酸和賴氨酸脫羧酶的菌株，經發酵生產1,5-戊二胺。但以上1,5-戊二胺生產方式導致賴氨酸脫羧酶/賴氨酸脫羧酶細胞的重復利用效率低、產物回收困難、生產成本高，不利于1,5-戊二胺的工業化生產。

在此之后，研究人員采用固定化細胞的方式生產1,5-戊二胺。日本專利申請JP2004298033A中公開了采用角叉菜膠，將產賴氨酸脫羧酶菌株包埋后培養產酶，然后收集培養好的固定化微生物，催化賴氨酸鹽脫羧，生產1,5-戊二胺，246g/L的賴氨酸鹽酸鹽經過固定化細胞150h的催化，生成的1,5-戊二胺濃度為40g/L，賴氨酸鹽酸鹽的摩爾轉化率約為30％。

文獻“用固定化L-賴氨酸脫羧酶細胞制備1，5-戊二胺”(蔣麗麗等，精細化工，2007，24(11)，1080-1084)中報道：采用3wt％的海藻酸鈣固定含有賴氨酸脫羧酶的細胞，此固定化細胞穩定性很差，第2批轉化時酶活就發生顯著下降，到第4批時酶活降低到約為第1批酶活的38％。