[發明專利]免疫檢測點雙阻斷CTL高效率殺傷細胞制劑的制備方法

有效

• 申請號: 201610716772.4
• 申請日: 2016-08-25
• 公開（公告）號: CN106177931B
• 公開（公告）日: 2018-02-02
• 發明（設計）人: 蔡守鋒;張偉;高飛;李冬斌;蔡子琪
• 申請（專利權）人: 河北濃孚雨生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61P35/00;C12N5/0784;C12N5/0783
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技術領域

本發明涉及一種抗腫瘤的細胞免疫治療新技術及新制劑，特別涉及一種新型、臨床型、腫瘤特異性免疫檢測點雙阻斷CTL高效率殺傷細胞制劑及其制備方法。

背景技術

細胞免疫治療經歷了LAK、DC-CIK、CTL及TIL的歷程，雖殺傷效率逐步提高，臨床試驗獲得了較好的臨床療效，但客觀有效率低仍是目前臨床亟待解決的主要問題。高效率腫瘤殺傷的技術關鍵在于，如何打破腫瘤免疫耐受、提高T細胞制劑的腫瘤特異性識別功能、強化效應T細胞的體內殺傷效率、以及降低臨床副反應等核心問題。

近年來，免疫檢測點阻斷成為細胞免疫治療的研究熱點。研究發現T細胞活化過程中釋放大量INF-γ，導致細胞表面的PD-1分子表達升高；而大多實體腫瘤細胞表面存在其配體PD-L1的高表達，二者結合后會啟動T細胞的抑制性信號通路，導致T細胞“耗竭”和無能。CTLA-4在T細胞活化的早期表達升高，其配體B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表達于DC表面，CTLA-4表達升高將與T細胞表面的CD28共刺激分子競爭性結合B7分子，發揮“免疫剎車”效應，導致T細胞“耗竭”和無能。有動物實驗研究證實，應用抗體阻斷T細胞表面的PD-1或CTLA-4，能夠有效促進T細胞的殺傷功能。同時有臨床試驗證實，人體應用抗PD-1、抗PD-L1、或抗CTLA-4抗體，能有效抑制腫瘤生長，部分病人腫瘤明顯縮小或消失。

本專利旨在發明一種新型、臨床型、腫瘤特異性免疫檢測點雙阻斷CTL（Dual-block CTL）的制備技術和殺傷細胞制劑，在打破腫瘤免疫耐受基礎上，大幅提高細胞免疫治療的客觀有效率。主要方法是，外周血獲取DC和T細胞并體外擴增；通過腫瘤抗原負載DC制備成治療型DC疫苗；T細胞擴增第7天加入DC疫苗活化，同時加入抗PD-1及CTLA-4抗體實施PD-1和CTLA-4雙阻斷，第10-15天收獲免疫檢測點雙阻斷CTL（Dual-block CTL）效應細胞制劑。

經體外體內殺傷實驗證實，Dual-block CTL的腫瘤特異性殺傷效率顯著高于現有DC-CIK及CTL技術，并具有臨床應用的安全性和可靠性。

發明內容

本發明的主要目的是解決目前細胞免疫治療臨床應用中，由于腫瘤微環境引起的腫瘤殺傷效率低、臨床客觀有效率低等問題，通過本發明的技術方法，可以顯著提高腫瘤的殺傷效率及臨床客觀有效率。

本發明提供了一種新型、臨床型、腫瘤特異性免疫檢測點雙阻斷CTL高效率殺傷細胞制劑及其制備方法。其中，DC細胞和T細胞可采用臍血造血干細胞來源或腫瘤病人自體外周血來源。

Dual-block CTL制備及主要實驗步驟：

1、腫瘤特異性抗原選擇：多種腫瘤抗原均適用于本專利涉及的效應細胞如：①、手術切除的新鮮腫瘤組織：離體30分鐘內液氮凍存，網搓法或酶消化法制備單細胞懸液，凍融法制備抗原蛋白，定量后-20℃保存備用；②、活檢獲得的新鮮腫瘤組織標本：網搓法或酶消化法制備單細胞懸液，凍融法制備抗原蛋白，定量后-20℃保存備用；③、胸腹水離心獲得的腫瘤細胞：過濾獲得單細胞懸液，凍融法制備抗原蛋白，定量后-20℃保存備用。

2、單狀核細胞采集：靜脈抽取或血液成分分離機（COBE?Spectra?）采集腫瘤病人外周血單狀核細胞（或采集臍血造血干細胞，制備同種異體DC用）100ml，常規抗凝，4℃環境送達GMP樣實驗室。

3、單狀核細胞分離：所采集單狀核細胞移入50ml離心管，1500rpm×10分鐘離心。收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清，4℃冷藏備用。收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管，應用水平轉頭離心機離心2000rpm×15分鐘，加速減速設定最小值。一次性吸管吸取中間白膜層，收集單狀核細胞。分別取15ml單狀核細胞移入含30ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心洗3次（1500rpm離心8分鐘、1250rpm離心8分鐘、1000rpm離心8分鐘）棄上清收獲單狀核細胞。

4、DC及T細胞分離：將單狀核細胞移入含AIM-V（GIBCO）培養基的培養瓶中，置于37℃，5%CO₂飽和濕度培養箱中孵育30-60分鐘取出，吸取懸浮T細胞移入新培養瓶另行擴增培養；粘附于瓶底的細胞即為DC細胞（臍血造血干細胞來源DC，需應用體外定向誘導及擴增技術獲取）。