[發(fā)明專利]免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷CTL高效率殺傷細(xì)胞制劑的制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610716772.4
• 申請(qǐng)日: 2016-08-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106177931B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡守鋒;張偉;高飛;李冬斌;蔡子琪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河北濃孚雨生物科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/00
• 分類號(hào): A61K39/00;A61P35/00;C12N5/0784;C12N5/0783
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷CTL高效率殺傷細(xì)胞制劑的制備方法，包括以下步驟：

（1）單狀核細(xì)胞的獲取；

（2）DC和T細(xì)胞的分選；

（3）DC擴(kuò)增和疫苗的制備；

（4）T細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增，具體包括：取細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含CD3單抗500ng/ml的無(wú)血清培養(yǎng)基AIM-V，將分選獲得的T細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日半量補(bǔ)充含500IU/ml IL-2的AIM-V培養(yǎng)基（IL-2培養(yǎng)基），后每3天補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基40%以上，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；

（5）T細(xì)胞活化和Dual-block CTL制備，具體包括：第7天DC疫苗收獲后，按DC:T=1:20的比例將DC疫苗加入T細(xì)胞培養(yǎng)瓶中共培養(yǎng)，使T細(xì)胞活化并制備成腫瘤特異性CTL效應(yīng)細(xì)胞；第8天加入抗人PD-1單抗3-15ug/ml及抗人CTLA-4單抗3-15ug/ml，進(jìn)行效應(yīng)細(xì)胞免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷，每3天補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基，培養(yǎng)10-15天收獲腫瘤特異性Dual-block CTL效應(yīng)細(xì)胞制劑，流式檢測(cè)Dual-block CTL表面PD-1及CTLA-4的表達(dá)持續(xù)低水平；所述效應(yīng)細(xì)胞選自T細(xì)胞來(lái)源的各種CTL、TIL、NK、CIK、以及各種T細(xì)胞亞型等細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷CTL高效率殺傷細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（1）具體包括：靜脈抽取或血液成分分離機(jī)采集腫瘤病人外周血單狀核細(xì)胞或臍血造血干細(xì)胞100ml，離心收集全血細(xì)胞，移入淋巴細(xì)胞分離液，水平轉(zhuǎn)頭離心2000rpm×15分鐘，吸取中間白膜層，加入生理鹽水吹打混勻，1500r/min離心5分鐘，棄上清，洗3遍，收集的細(xì)胞為單狀核細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷CTL高效率殺傷細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）具體包括：將收集的單狀核細(xì)胞移入含無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘取出，粘附于瓶底的DC細(xì)胞另行培養(yǎng)，制備DC疫苗；吸取懸浮T細(xì)胞移入新培養(yǎng)瓶另行培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷CTL高效率殺傷細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟（3）具體包括：上述貼壁的DC細(xì)胞中加入含GM-CSF為1000IU/ml和IL-4為600IU/ml的AIM-V培養(yǎng)基20ml，置于37℃，5%CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)；第3天補(bǔ)液，第5天加入特異性腫瘤抗原50ug/ml，第7天收獲特異性DC疫苗。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷CTL高效率殺傷細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，所述腫瘤抗原選自病人自體腫瘤抗原、各種抗原肽、融合腫瘤細(xì)胞抗原、凋亡腫瘤細(xì)胞抗原、衰老腫瘤細(xì)胞抗原、各種重組蛋白、腫瘤DNA、腫瘤RNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的免疫檢測(cè)點(diǎn)雙阻斷CTL高效率殺傷細(xì)胞制劑的制備方法，其特征在于，IL-2培養(yǎng)基中加入10U/ml的IL-15。