[發明專利]一種青蒿鯊烯合酶基因及其cDNA的克隆方法

在審

• 申請號: 201610715468.8
• 申請日: 2016-08-25
• 公開（公告）號: CN107779449A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 楊美寧
• 申請（專利權）人: 楊美寧
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/54
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種青蒿鯊烯合酶基因及其cDNA的克隆方法，具體地說是以一種青蒿鯊烯合酶基因及其cDNA的克隆方法。

背景技術

目前公知的青蒿素是我國自主研發的抗瘧原蟲中藥有效單體，對氯奎抗性瘧原蟲有效，現已成為全球抗瘧藥的希望。青蒿素是青蒿經類異戊二烯次生代謝途徑所形成的倍半萜衍生物。利用基因工程對青蒿進行基因敲變（knockdown）或敲除（knockout）已成為青蒿遺傳改良的兩大方向。

發明內容

診斷標準：

研究對象：青蒿（Artemisia annua L．）采自我國海南省三亞市（由四川引種）。試劑；植物DNA提取試劑盒（E．Z．N．A．Plant DNA Kit）、植物RNA提取試劑盒（E．Z．N．A．Plant RNA Kit）均購自Omega公司；質粒DNA純化試劑盒（Concert Rapid Plasmid Miniprep System）、DNA片段回收試劑盒（Concert Rapid Gel Extraction System）均購自 Life Technologies公司；聚合酶鏈反應（PCR）擴增試劑盒 （One Shot LA PCR Mix）及逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）擴增試劑盒（mRNA Selective PCR Kit）均購自 Takara公司；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。方法 ：DNA的提取；按植物DNA提取試劑盒說明書提取青蒿植株的DNA。RNA的提取，按植物RNA提取試劑盒說明書提取青蒿植株的總RNA。引物設計，委托Takara公司合成。PCR 擴增，以提取的青蒿DNA為模板，SSPri5、SSPri3為上下游引物，用Takara公司的One Shot LA PCR Mix擴增，擴增條件為：94℃，1min-94℃，30s，57℃，1min，72℃，5，min，30個循環-72℃，10，min→4℃。RTPCR擴增，以提取的青蒿RNA為模板，SSPri5、SSRNA為上下游引物，用Takara公司的mRNA Selective PCR Kit擴增，擴增條件為： 50℃，30s→85℃，1min，50℃，1min，72℃，5min，30個循環→72℃，10min→4℃。構建重組質粒將PCR產物及RTPCR產物分別與pTarge T載體（Promega公司）連接，轉化DH5α感受態細胞，涂板，藍白斑篩選重組子。重組質粒鑒定測序Life Technologies公司的試劑盒提取質粒，分別經PCR擴增和EcoRⅠ酶切進行鑒定。PCR擴增采用Promega公司的Tf1酶，反應條件為：94℃，1min-94℃，30s，57℃，1min，72℃，5min，30個循環-72℃，10min→4℃。最后在ABIPrism310DNA測序儀上用T7啟動子引物測序。結果：鯊烯合酶互補DNA（cDNA）擴增青蒿植株RNA經RTPCR擴增和10g/L凝膠電泳后，可檢測到長度約為1300bp的DNA區帶。鯊烯合酶基因擴增青蒿植株DNA經PCR擴增和10g/L凝膠電泳后，可檢測到長度約為3 600 bp的DNA區帶。鯊烯合酶基因克隆和鑒定將擴增片段插入pTarge T載體后，獲得重組質粒pTSSD。對pTSSD 進行PCR擴增，經10g/L凝膠電泳檢測，可見與青蒿植株DNA的PCR產物大小相當的區帶，表明上述擴增片段已與載體連接。將重組質粒用EcoRⅠ酶切，經10g/L凝膠電泳后，可見一條略比青蒿植株DNA的PCR產物大的基因區帶和另一條載體帶。按實驗設計，鯊烯合酶基因擴增片段的理論長度應為3590bp，插入T載體（5670bp）并用EcoRI酶切后，含有鯊烯合酶基因的酶切片段中尚包括68bp載體片段，其實際長度應為3658bp。實驗結果與此分析相符，初步表明青蒿鯊烯合酶基因已被克隆。鯊烯合酶cDNA克隆和鑒定將擴增片段插入pTarge T載體后獲得重組質粒pTSSR。對pTSSR進行PCR擴增，經10 g/L凝膠電泳后檢測到與青蒿植株RNA的RTPCR產物大小相當的區帶，表明上述擴增片段已與載體連接。將重組質粒用EcoRⅠ酶切，經10g/L凝膠電泳后，可見一條略比青蒿植株RNA的RTPCR產物大的基因區帶和另一條載體帶。按實驗設計，鯊烯合酶cDNA 擴增片段的理論長度應為1257bp，插入T載體（5670bp）并用EcoRⅠ酶切后，含有鯊烯合酶cDNA 的酶切片段中包括68bp載體片段，其實際長度應為1325bp。實驗結果與此分析相符，初步表明鯊烯合酶cDNA已被克隆。鯊烯合酶基因及其cDNA序列分析，對上述兩種重組質粒中的插入片段進行序列分析，結果顯示pTSSD的插入片段為3590bp，pTSSR的插入片段為1258bp。經與GenBank中所發表的序列比較，顯示兩者都含有13個內含子，但序列之間存在某些堿基對的差別，推測這些差異可能源于單核苷酸多態性（SNP）。鯊烯合酶基因及cDNA序列已被Genbank收錄，編號分別為AY445505和AY445506。測序結果與GenBank上已登錄的青蒿鯊烯合酶基因序列同源性為99%，氨基酸序列同源性為100%。λDNA/EcoRI+HindIII Markers； 2-4．RTPCR產物。