[發明專利]一種零背景的平末端克隆載體pUB857及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201610709625.4
• 申請日: 2016-08-23
• 公開（公告）號: CN107760703A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 汪洋;張開;易軍;蘇會娟
• 申請（專利權）人: 南京理工大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 南京理工大學專利中心32203
• 代理人: 劉海霞,朱顯國

技術領域

本發明涉及一種零背景的平末端克隆載體pUB857及其構建方法和應用，具體涉及一種用溫敏型啟動子cI857-P_R控制毒素基因ccdB的表達以此作為反篩選標記的pUB857克隆載體及其在基因克隆和基因文庫構建中的應用，屬于生物技術領域。

技術背景

隨著現代生物技術的發展，各種分子克隆技術應運而生。分子克隆技術，即在分子層次上克隆特定DNA序列用以表達目標蛋白的方法，常采用酶切或PCR的方式獲得目的DNA片段，純化后用體外重組的方法將目的DNA序列插入克隆載體，而后通過轉化方式將重組質粒導入適合的寄主菌中，如DH5α，DH10B等，再從篩選的宿主菌中提取和酶切鑒定所需的重組質粒，最終獲得目的基因。基因的克隆一般采用下列技術：酶切—酶連、融合PCR以及同源重組。傳統的重組克隆篩選依賴于繁瑣耗時的菌落PCR或酶切驗證，難以滿足目前高通量基因篩選與功能驗證的要求。采用毒素基因作為反篩選標記以避免空載體的干擾，能顯著減少工作量和縮短工作時間。

DNA促旋酶是細菌中的一種2型拓撲異構酶，以四聚體的形式存在，分別由gyrA和gyrB基因所編碼的2個A亞基和2個B亞基所形成。該酶在DNA分子由超螺旋狀態變化成弛緩型狀態的過程中起決定作用，是維持DNA分子穩定存在所必須的一種酶。其中，ccdB是由101個氨基酸所編碼的一種基因毒素蛋白，可與大腸桿菌DNA促旋酶直接結合，使其失去活性，從而導致DNA分子不會產生超螺旋，從而無法修復己切割的DNA，最終導致細胞凋亡(Bernard P,Couturier M.Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes[J].Journal of molecular biology,1992,226(3):735-745.)。溫敏型啟動子PR受阻遏蛋白cI857的調控，當溫度低于30℃時，阻遏蛋白cI857能穩定地抑制ccdB基因的表達，而當溫度在37℃時，阻遏蛋白cI857因熱失活而導致毒素基因ccdB的表達(Villaverde A,et al.Fine regulation of cI857-controlled gene expression in continuous culture of recombinant Escherichia coli by temperature[J].Applied and environmental microbiology,1993,59(10):3485-3487.)。

發明內容

針對基因克隆中的實際問題和需求，本發明提供了一種零背景的平末端克隆載體pUB857，該零背景平末端快速連接載體用溫敏型啟動子cI857-P_R控制毒素基因ccdB的表達以此作為反篩選標記的pUB857克隆載體，可以高效克隆平末端PCR產物和任何具有平末端的DNA片段。

本發明的技術方案如下：

一種零背景的平末端克隆載體pUB857，為利用PvuII酶切pUC19質粒形成線性DNA鏈，同時在酶切位點連接ccdB和cI857-P_R形成的全長序列為SEQ ID NO.9的克隆載體，所述的ccdB開放閱讀框上設計有SmaI酶切位點。

進一步地，本發明還提供上述零背景的平末端克隆載體pUB857的構建方法，包括引物設計、基因克隆和載體構建，通過合成引物PCR擴增cI857-P_R目的片段和ccdB目的片段，并將pUC19質粒DNA用限制性內切酶PvuII進行酶切，回收線性化片段pUC19，最后將ccdB、cI857-P_R、線性化pUC19片段進行連接，得到克隆載體pUB857。