[發明專利]篩選基因編輯產物的方法

有效

• 申請號: 201610695151.2
• 申請日: 2016-08-19
• 公開（公告）號: CN106319045B
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 王克劍;華宇峰;王春
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 33212 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種ACT?PCR篩選基因編輯產物的方法，包括如下步驟：1)、提取野生型及待測樣品的基因組DNA；2)、設計引物：使正向引物FA的3’末端跨過基因編輯擬切割位點；反向引物RA是以目標基因的基因組序列為參照，位于互補鏈的下游，反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；3)、獲得最大臨界退火溫度T_am和最小臨界退火溫度T_lm；4)、利用引物對FA/RA以基因組DNA為模板、設定退火溫為T_lm<Tm≤T_am之間，進行PCR擴增；5)、將擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離；能夠擴增出目的條帶所對應的樣品為野生型或者雜合突變體；不能擴增出目的條帶所對應的樣品為純合突變體。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用ACT-PCR篩選基因編輯產物的方法與應用。

背景技術

近年來，利用ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、Cpf1、Ago等基因編輯系統，在多個物種中成功實現了基因組的定點編輯。這些系統可對基因組中特定的DNA序列進行精細改造，在特定位置敲除或者插入基因。利用這些系統進行基因組編輯會產生大量的突變體，因此鑒定這些突變體的工作量巨大。而目前對基因編輯突變體的篩選主要有以下幾種方法：PCR酶切(PCR/RE)檢測法，T7EI酶切法，高分辨率溶解曲線分析法等。這些方法在實際應用中存在一定缺陷：PCR/RE檢測法只適用于編輯位點處存在限制性內切酶切點的靶序列，這個條件限制了靶序列的選擇；T7EI酶切法適合鑒定雜合突變體，但對純合突變體的鑒定相對繁瑣，不利于實際應用；利用高分辨率溶解曲線分析法需要昂貴的儀器。這些鑒定方法限制了大規模高通量地篩選基因編輯后產生的突變體。與此同時，目前鑒定通過基因編輯的方法得到的混合細胞系主要用的PCR/RE和T7EI酶切法，并不能精確定量細胞系中的突變效率。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種ACT-PCR篩選基因編輯產物(突變體)的方法，采用本發明的方法能簡單、快捷、廉價、高通量地鑒定基因編輯產物(突變體)。在此基礎上結合實時熒光定量PCR技術，還可以精確定量細胞系中的突變效率。

本發明利用PCR反應程序中，退火溫度決定引物與模板結合效率的特點，根據野生型序列，在突變位點附近設計特異正向引物及退火溫度略高于正向引物的反向引物，在嚴格的退火溫度范圍內，通過常規PCR反應來鑒定基因編輯突變體。其中，由于特異的正向引物與突變體模板不能完全匹配，在嚴格的退火溫度下不能進行有效擴增，因此不能擴增得到PCR產物的樣品即為突變序列。

為了解決上述技術問題，本發明提供一種ACT-PCR篩選基因編輯產物的方法，包括如下步驟：

1)、提取野生型及待測樣品的基因組DNA，以獲得PCR模板；

備注說明：待測樣品是以野生型為背景材料，基因編輯后得到的待鑒定材料；

2)、引物設計：

以目標基因的基因組序列為參照，設計ACT-PCR正向引物FA，使正向引物FA的3’末端跨過基因編輯擬切割位點；反向引物RA是以目標基因的基因組序列為參照，位于互補鏈的下游(位于正向引物下游)，設計反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；設計策略如圖1所示。

3)、利用步驟2)的引物對FA/RA以野生型基因組DNA為模板進行退火溫度梯度PCR擴增；將所得的擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離；

能夠擴增出目的條帶所對應的最高溫度為臨界退火溫度T_am；

模型如圖2所示，其中第8點樣孔所對應的T_m即為臨界退火溫度T_am，作為后續的ACT-PCR退火溫度。

利用步驟2)的引物對FA/RA以已知突變體基因組DNA為模板進行退火溫度梯度PCR擴增；將所得的擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離；