[發明專利]篩選基因編輯產物的方法

有效

• 申請號: 201610695151.2
• 申請日: 2016-08-19
• 公開（公告）號: CN106319045B
• 公開（公告）日: 2020-01-31
• 發明（設計）人: 王克劍;華宇峰;王春
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 33212 杭州中成專利事務所有限公司
• 代理人: 金祺

1.ACT-PCR篩選基因編輯產物的方法，其特征是包括如下步驟：

1)、提取野生型及待測樣品的基因組DNA，以獲得PCR模板；

2)、設計引物：

以目標基因的基因組序列為參照，設計ACT-PCR正向引物FA，使正向引物FA的3’末端跨過基因編輯擬切割位點；反向引物RA是以目標基因的基因組序列為參照，位于互補鏈的下游，反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；

正向引物FA的3’末端跨過基因編輯擬切割位點為2～6bp；

正向引物FA的長度為20bp；

3)、利用步驟2)的引物對FA/RA以野生型基因組DNA為模板進行溫度梯度PCR擴增；將所得的擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離；

能夠擴增出目的條帶所對應的最高溫度為最大臨界退火溫度T_am；

利用步驟2)的引物對FA/RA以已知突變體基因組DNA為模板進行退火溫度梯度PCR擴增；將所得的擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離；

能夠擴增出目的條帶所對應的最高溫度為最小臨界退火溫度T_lm；

4)、利用步驟2)的引物對FA/RA以步驟1)所提取的基因組DNA為模板、設定退火溫為T_lm<Tm≤T_am之間，進行PCR擴增；

5)、將步驟4)所得的擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離；

能夠擴增出目的條帶所對應的樣品為野生型或者雜合突變體；

不能擴增出目的條帶所對應的樣品為純合突變體。

2.根據權利要求1所述的ACT-PCR篩選基因編輯產物的方法，其特征是：該方法還包括如下的步驟6)：

6)、結合實時熒光定量PCR檢測細胞系中基因編輯效率；提取未編輯及經編輯的細胞系DNA為模板，設定退火溫度為T_am，進行實時熒光定量PCR檢測；設定Ct^A1為未編輯細胞系樣本目標基因Ct值，Ct^B1為它的內參基因Ct值；設定Ct^A2為經編輯細胞系樣本目標基因Ct值，Ct^B2為它的內參基因Ct值，根據公式計算得到ΔΔCt＝(Ct^A2–Ct^B2)-(Ct^A1–Ct^B1)，則經編輯細胞系中目標基因的檢測水平是未經編輯細胞系的2^-ΔΔCt倍，即在經編輯細胞系中，有(1-2^-ΔΔCt)×100％的目標基因發生了編輯。

3.根據權利要求1或2所述的ACT-PCR篩選基因編輯產物的方法，其特征是：

所述步驟2)中：

正向引物FA的引物序列為N_1-20；

對于目標基因正向引物對應的基因組序列為N₁NNNNNNNNNNNNNNN↓NNNN₂₀，↓表示基因編輯擬切割突變位點，所對應的正向引物FA為N_1-20。

4.根據權利要求3所述的ACT-PCR篩選基因編輯產物的方法，其特征是：

所述步驟2)中：

正向引物FA：N₁NNNNNNNNNNNNNNNNNNN₂₀。

5.根據權利要求4所述的ACT-PCR篩選基因編輯產物的方法，其特征是：

所述步驟4)中：

PCR擴增體系和程序如下：

反應程序：94℃，變性2分鐘；然后94℃變性30秒，T_am退火30秒，72℃延伸30秒，擴增33個循環；最后在72℃下延伸2分鐘。