[發(fā)明專利]活化的人凝血因子VII融合蛋白及其制備方法與用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610692686.4
• 申請(qǐng)日: 2016-08-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106279436B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李強(qiáng);朱文臣;高永娟;朱成功;李媛麗;王曉山;孫乃超;劉賓;王文文;李智;劉婷婷;朱鹿燕;李亦清;任子甲;朱松林;肖春峰;蘇鴻聲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安源醫(yī)藥科技（上海）有限公司;輔仁藥業(yè)集團(tuán)有限公司;旭華（上海）生物研發(fā)中心有限公司;開(kāi)封制藥（集團(tuán)）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C12N9/64;C12N15/62;A61K38/48;A61K38/24;A61K47/68;A61P7/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種融合蛋白，更具體地，涉及一種活化的人凝血因子VII(FVIIa)融合蛋白及其制備方法和用途，特別是在用于制備治療多種凝血相關(guān)疾病藥物中的用途。

背景技術(shù)

FVII是一種維生素K依賴性的血漿糖蛋白，在肝臟中合成，并以分子量約為53KDa的單鏈蛋白酶原形式分泌到血液中(Broze等,J Biol Chem,1980,255:1242-1247)。FVII酶原在單一位點(diǎn)Arg152-Ile153處被蛋白酶水解，產(chǎn)生由一個(gè)二硫鍵連接的雙鏈，從而轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚孕问紽VIIa。活化的FVIIa包含NH2-末端衍生的輕鏈(約20KDa)和COOH-末端衍生的經(jīng)由單一二硫鍵(Cys135至Cys262)連接的重鏈(約30KDa)。輕鏈含有細(xì)胞膜結(jié)合Gla結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)“類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)結(jié)構(gòu)域”，而重鏈含有絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。處于活化形式時(shí)，F(xiàn)VIIa作為絲氨酸蛋白酶，參與凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的外源性途徑(extrinsic pathway)。在血友病治療中使用FVIIa是基于FVIIa對(duì)于凝血酶活化的血小板表面低親和性結(jié)合，通過(guò)給予藥物學(xué)劑量的外源性FVIIa，使損傷位處血小板表面凝血酶產(chǎn)生被增強(qiáng)，這與FVIII/FIX存在無(wú)關(guān)，即繞開(kāi)對(duì)于FVIIIa和FIXa的需求來(lái)起到止血作用。因此，F(xiàn)VIIa可用于產(chǎn)生抑制物的血友病患者出血性狀況的預(yù)防和治療。市售的重組凝血因子VIIa目前只有(Novo Nordisk，丹麥)。該藥已在全世界范圍內(nèi)被批準(zhǔn)用于治療產(chǎn)生FVIII或FIX抗體(抑制物)的血友病A或B患者、先天性FVII缺陷的患者以及終止與外傷和/或手術(shù)相關(guān)的出血事件或預(yù)防出血。

然而，治療性凝血蛋白藥物包括FVIIa在內(nèi)會(huì)被蛋白水解酶快速降解，并且易被抗體中和，這導(dǎo)致其體內(nèi)循環(huán)半衰期大幅降低，由此限制了它們的療效。重組FVIIa在人體內(nèi)循環(huán)半衰期約為2.3小時(shí)，需要每隔2-3小時(shí)注射一次。

為了提高FVIIa的體內(nèi)半衰期，由CSL Behring公司開(kāi)發(fā)的rFVIIa-FP(白蛋白與FVIIa的C端融合)已完成臨床I期研究，它在正常受試者中的血清半衰期與市售FVIIa相比提高了3-4倍(Golor G等,J Thromb Haemost,2013,11(11):1977-85)，生物學(xué)活性為620-770IU/mg，相當(dāng)于69-75IU/nM(Weimer T等，Thromb Haemost,2008,99:659-667)。

FVIIa的聚乙二醇化脂質(zhì)體制劑PEGLip-FVIIa(Omri公司開(kāi)發(fā))也處于臨床早期，并且其血清半衰期僅為天然FVIIa的2倍。此外，由諾和諾德公司開(kāi)發(fā)的N-糖基定點(diǎn)PEG化修飾FVIIa(N7-GP)相對(duì)rFVIIa延長(zhǎng)了約5倍，但由于臨床II期數(shù)據(jù)缺乏量-效線性關(guān)系且有受試者發(fā)生了過(guò)敏反應(yīng)，該項(xiàng)目已終止研究(Ljung R等,J Thromb Haemost,2013,11(7):1260-8)。

由Biogen公司開(kāi)發(fā)的rFVIIaFc單體-二聚體雜合型(monomer/dimer hybrid)融合蛋白仍處于早期研究階段，研究顯示Monomeric rFVIIaFc在A型血友病小鼠體內(nèi)的終末半衰期為6.6小時(shí)，為對(duì)照組rFVIIa的5.5倍。在靜脈注射rFVIIaFc 5分鐘時(shí)，小鼠凝血活性即恢復(fù)至正常值的40％，然而在起始階段其活性會(huì)急劇衰減，在給藥后30分鐘即下降到20％左右，給藥后1小時(shí)已下降至約10％，這與在0～1小時(shí)的下降趨勢(shì)相似。雖然給藥1h后與rFVIIa相比，rFVIIaFc組活性下降趨勢(shì)有所變緩，但在靜注rFVIIaFc 8小時(shí)后，活性已降至1％左右，已低于凝血活性基線水平，無(wú)法有效止血。這暗示rFVIIaFc僅在短時(shí)間內(nèi)可有效控制急性出血癥狀，并不能長(zhǎng)期、平穩(wěn)、有效地維持機(jī)體的正常凝血功能。體外凝血活性試驗(yàn)顯示rFVIIaFc摩爾比活性為1115IU/nM，與(2511IU/nM)相比下降約60％，研究者認(rèn)為這種活性降低是由于融合配體Fc的空間位阻效應(yīng)引起的，這使得它與可溶性組織因子(sTF)的結(jié)合常數(shù)(Kd)下降(J.Salsa等,Thrombosis Research,2015,135:970–976)。此外，本發(fā)明人之前構(gòu)建的一種同源二聚體型rFVIIa-Fc，雖然其半衰期大幅延長(zhǎng)，但也存在活性降低的問(wèn)題，體外活性也僅為208-240IU/nM(中國(guó)發(fā)明專利號(hào)：CN104774269B)。