[發明專利]一種CHO-Dhfr表達系統細胞株的高通量篩選方法

有效

• 申請號: 201610692407.4
• 申請日: 2016-08-18
• 公開（公告）號: CN106318970B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 劉靜;楊彬;張彩霞;陳華林;陳莉;孫文正;李文佳
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02
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本發明涉及細胞工程領域，具體涉及一種CHO?Dhfr表達系統細胞株的高通量篩選方法。該方法采用氨甲喋呤三輪加壓，選擇細胞活力在40％～50％的細胞池，在特定的半固體培養基中進行單克隆化，該方法克隆形成率顯著提高，且能夠在較短時間內篩選出更多的表達量高且穩定的菌株。

技術領域

本發明涉及細胞工程領域，具體來說，涉及一種CHO-Dhfr表達系統細胞株的高通量篩選方法。

技術背景

用于單克隆抗體或者分子量較大的重組蛋白藥物生產的“工程細胞”系需具備以下特性：生長特性良好，無血清懸浮培養密度高(1～2×10⁷cell/ml)；異源蛋白表達能力強(20～70pg/cell/day，pcd)，具備正確的翻譯后修飾能力；宿主及重組細胞系遺傳背景清晰、表型穩定，符合相關法規要求。

目前，業內細胞系構建中最常用的篩選體系之一是CHO-Dhfr系統。CHO細胞即中華倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary)，DHFR是指二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase)，催化二氫葉酸轉還原為四氫葉酸，DHFR基因敲除的CHO細胞(如Invitrogen的DG44)不能合成四氫葉酸，只能在添加胸苷、甘氨酸和嘌呤的培養基中生長。該系統是將外源基因插入到含有DHFR基因表達載體的下游，并轉入至宿主細胞DG44細胞，這樣便可在不含胸苷、甘氨酸和嘌呤的培養基中生長。在細胞培養時添加DHFR的抑制劑氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)，使MTX基因及與之相連的目的基因一起擴增，達到增加目的基因拷貝數，從而提高目的基因表達水平的目的。

細胞株篩選的目的在于獲得穩定高產的細胞株，其衡量標準包括抗體表達量、產品質量、代謝穩定性、細胞基質穩定性等。常規的篩選方法是：表達構建體的構建→轉染至宿主細胞→加壓篩選獲得細胞池→細胞池(cell pool)的單克隆化→高表達細胞株擴大培養及篩選→細胞株的穩定性評估。

細胞池常規獲得的方法是：當表達構建體被轉染到宿主細胞內，采用多輪加壓的策略，直至表達量上升幅度不大后，前一輪為最高加壓輪次。將其細胞復蘇后，待細胞活力>95％后即為細胞池，或者是用前面提到的細胞池做流式細胞分選表達量TOP2～5％的細胞，待細胞活力再次>95％后即為細胞池。一般來說，在同樣的培養環境下，低表達細胞株將營養成分更多用在細胞生長上，故生長較快，而高表達細胞株生長較慢，因此，以上提到的兩種活力>95％的細胞池在細胞活力逐漸恢復的過程中，大多數高表達細胞株越長越慢，以至于喪失；而低表達細胞株越長越快；最終導致細胞池的高表達細胞株含量低，低表達的細胞株含量高。同時，在細胞活力恢復的過程中，增加細胞傳代次數，據實驗經驗，每經歷一次細胞活力恢復，細胞增加15～20 Generations(Generation，世代，細胞每倍增一次，稱為1Generation)，影響細胞株的穩定性。

單克隆化篩選最常規的方法是有限稀釋(limiting dilution cloning，LDC)，低成本且易于操作，即將細胞密度按照<1cell/孔鋪至96孔板中，培養基為液體培養基，大多時候會按照需求添加一定比例的條件培養基(含有細胞生長因子)，對細胞生長狀態要求極高，活力<90％的細胞池幾乎很難存活，克隆效率極低，即使單克隆化活力>95％的細胞池，克隆效率最高也僅有7％左右，平均水平在3％～4％，且操作繁瑣，工作量大，實驗周期長，實驗效率低，無法實現高通量篩選。

用半固體培養基法進行單克隆化篩選，它是將細胞池按照一定的密度鋪于半固體培養基上形成單克隆，繼而挑選出來逐步擴大培養及篩選高表達細胞株。目前逐漸使用ClonePix2這類高通量篩選儀器在各種半固定培養基上進行高通量篩選，然而參照現有文獻，如何提高克隆形成率及更快更易篩選出穩定高表達細胞株一直是本領域的技術難點。

發明內容