[發(fā)明專利]一種CHO-Dhfr表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞株的高通量篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610692407.4
• 申請(qǐng)日: 2016-08-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106318970B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉靜;楊彬;張彩霞;陳華林;陳莉;孫文正;李文佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東東陽(yáng)光藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種CHO-Dhfr表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞株的高通量篩選方法，包含以下步驟：（1）表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建，（2）轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞，（3）氨甲喋呤加壓篩選獲得細(xì)胞池，（4）細(xì)胞池在半固體培養(yǎng)基上進(jìn)行單克隆化，（5）利用高通量細(xì)胞篩選系統(tǒng)篩選細(xì)胞株，（6）細(xì)胞株的穩(wěn)定性評(píng)估；其特征在于，步驟（4）所述的細(xì)胞池的細(xì)胞活力為40%~50%，所述的半固體培養(yǎng)基中含有條件培養(yǎng)基與甲基纖維素，條件培養(yǎng)基占半固體培養(yǎng)基總體積的10%，甲基纖維素在半固體培養(yǎng)基中的含量為0.9~1.5g/L；

其中，所述的條件培養(yǎng)基的制備方法為：取已經(jīng)轉(zhuǎn)染載體的穩(wěn)定細(xì)胞株在添加8mM谷氨酰胺的OptiCHO Medium中進(jìn)行批培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至密度在0.9×10⁷~1.1×10⁷cells/mL之間且細(xì)胞活力>95%時(shí)，經(jīng)過(guò)離心分離上清和細(xì)胞，取上清過(guò)濾后即得；所述載體為pOptiVEC，含有Dhfr基因，不含有其它外源蛋白的基因；所述細(xì)胞株為DG44細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）所述的氨甲喋呤加壓篩選分為三輪，氨甲喋呤的濃度依次為100 nM、1000 nM、5000 nM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4）所述在半固體培養(yǎng)基上進(jìn)行單克隆化，其中，半固體培養(yǎng)基中細(xì)胞終濃度為150 cells/mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟（4）所述的半固體培養(yǎng)基中還含有1%體積比的熒光抗體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）所述表達(dá)構(gòu)建體，為表達(dá)抗TNFα全人源抗體重鏈和輕鏈的載體。