[發明專利]一種用于牛鼻支原體分離純化的培養基及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201610689925.0
• 申請日: 2016-08-19
• 公開（公告）號: CN106635865B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 郝華芳;陳勝利;儲岳峰;趙萍;劉永生
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;C12R1/35
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 張秋云

1.一種用于牛鼻支原體分離純化的液體培養基，其特征在于，每1000ml液體培養基是由以下組分制備得到的：PPLO肉湯10.5 g、腦心浸出液8.0 g、氯化鈉4.0 g、硫酸鎂0.05 g、氯化鉀0.2 g、氯化鈣0.09 g、磷酸氫二鈉0.024 g、磷酸二氫鉀0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鮮酵母浸出液60 ml、1%酚紅2.5 ml、無菌豬血清100 ml、無菌馬血清100 ml、氨芐青霉素100 mg、10%醋酸鉈1 ml、余量為去離子水；

所述25%新鮮酵母浸出液的制備方法為：取鮮酵母500g，加入去離子水2000 ml中，攪拌溶解，用鹽酸溶液調pH值至4.5-5.0，80℃水浴30分鐘，3000 轉/分離心20分鐘，取上清液，將上清液用1 M NaOH調pH值至7.8，煮沸，置室溫放涼后用雙層濾紙過濾，再補水至2000ml，即得到25%新鮮酵母浸出液，-20℃保存備用；所述鹽酸溶液中，按照體積比濃鹽酸：水為1：1。

2.一種用于牛鼻支原體分離純化的固體培養基，其特征在于，所述用于牛鼻支原體分離純化的固體培養基中，每1000ml固體培養基是由以下組分制備得到的：PPLO肉湯10.5 g、腦心浸出液8.0 g、氯化鈉4.0 g、硫酸鎂0.05 g、氯化鉀0.2 g、氯化鈣0.09 g、磷酸氫二鈉0.024 g、磷酸二氫鉀0.03 g、葡萄糖5.0 g、水解乳蛋白5.0 g、25%新鮮酵母浸出液60 ml、無菌豬血清100 ml、無菌馬血清100 ml、氨芐青霉素100 mg、10%醋酸鉈1 ml、瓊脂粉15.0g、余量為去離子水；

所述25%新鮮酵母浸出液的制備方法為：取鮮酵母500g，加入去離子水2000 ml中，攪拌溶解，用鹽酸溶液調pH值至4.5-5.0，80℃水浴30分鐘，3000 轉/分離心20分鐘，取上清液，將上清液用1 M NaOH調pH值至7.8，煮沸，置室溫放涼后用雙層濾紙過濾，再補水至2000ml，即得到25%新鮮酵母浸出液，-20℃保存備用；所述鹽酸溶液中，按照體積比濃鹽酸：水為1：1。

3.一種權利要求1所述的用于牛鼻支原體分離純化的液體培養基的制備方法，其特征在于，每1000ml液體培養基的制備方法為：

1）稱取腦心浸出液8.0 g、氯化鈉4.0 g、硫酸鎂0.05 g、氯化鉀0.2 g、氯化鈣0.09 g、磷酸氫二鈉0.024 g、磷酸二氫鉀0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去離子水混勻，加熱溶解，再加入1%酚紅2.5 ml，混合后115℃高壓滅菌20分鐘，作為A液；

2）稱取PPLO肉湯10.5 g、水解乳蛋白5.0 g，量取60 ml 25%新鮮酵母浸出液，加去離子水至300 ml，混合后115℃高壓滅菌20分鐘，作為B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入無菌豬血清和馬血清各100 ml，再加入濾過除菌100 mg/ml氨芐青霉素1 ml和滅菌的10%醋酸鉈1 ml，用滅菌去離子水調至1000 ml，用滅菌1 M NaOH調pH值到7.2-7.4，充分搖勻，得到液體培養基，置4℃保存備用。

4.一種權利要求2所述的用于牛鼻支原體分離純化的固體培養基的制備方法，其特征在于，每1000ml固體培養基的制備方法為：

1）稱取腦心浸出液8.0 g、氯化鈉4.0 g、硫酸鎂0.05 g、氯化鉀0.2 g、氯化鈣0.09 g、磷酸氫二鈉0.024 g、磷酸二氫鉀0.03 g、葡萄糖5.0 g，加490 ml去離子水混勻，加熱溶解，混合后115℃高壓滅菌20分鐘，作為A液；

2）稱取PPLO肉湯10.5 g、水解乳蛋白5.0 g、瓊脂粉15.0 g，量取60 ml/L 25%新鮮酵母浸出液，加去離子水至300 ml，混合后115℃高壓滅菌20分鐘，作為B液；

3）待A液、B液晾至50℃-55℃混合后，再在其中加入無菌豬血清和馬血清各100 ml，再加入濾過除菌100 mg/ml的氨芐青霉素1 ml和滅菌的10%醋酸鉈1 ml，用滅菌去離子水調至1000 ml，用滅菌1M NaOH調pH值到7.2-7.4，搖勻，倒平皿，得到固體培養基，置4℃保存備用。