[發明專利]一種exosome來源的與肝癌相關的miRNA標志物及其應用

在審

• 申請號: 201610675107.5
• 申請日: 2016-08-17
• 公開（公告）號: CN107760781A
• 公開（公告）日: 2018-03-06
• 發明（設計）人: 周宇;陳莉
• 申請（專利權）人: 周宇;陳莉
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/113
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種與肝癌相關的miRNA標志物及其在診斷人類肝癌中的用途，其特征在于，所述miRNA標志物為腫瘤源性的exosome來源的miRNA-46a，其序列為：5’-UUCAUUCAUUACUUUUGUACGC-3’。

2.一種檢測權利要求1所述miRNA標志物的試劑，其特征在于，所述試劑是用于擴增所述miRNA-46a的引物對，或者是用于檢測所述miRNA-46a的探針；優選地，用于擴增所述miRNA-46a的正向引物為：5’-actcaccagctggccattattacttttggta-3’，反向引物為：5’-cgccgcagtgcgtgtcgtggagt-3’。

3.一種診斷人類肝癌的試劑盒，其特征在于，包含權利要求2所述的試劑，優選地，還包含PCR反應常用的試劑和酶。

4.權利要求2所述的試劑在制備用于診斷人類肝癌的試劑盒中的用途。

5.權利要求2所述的試劑在診斷人類肝癌中的用途。

6.一種檢測權利要求1所述的miRNA標志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)分離純化血液中腫瘤源性的exosome；

(2)提取樣本總RNA；

(3)將步驟(2)獲得的RNA逆轉錄成cDNA；

(4)在熒光實時定量PCR儀上將步驟(3)獲得的cDNA和參照基因進行擴增檢測；

(5)通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進行相對定量；

優選地，所述步驟(4)中對cDNA進行擴增檢測時所用的正向引物為：5’-actcaccagctggccattattacttttggta-3’，反向引物為：5’-cgccgcagtgcgtgtcgtggagt-3’。

7.權利要求6所述的方法在診斷人類肝癌中的用途。

8.一種從少量血清中快速提取exosome的試劑，所述試劑是用于沉淀exosome的聚合物，優選地，所述試劑是北京捷騰生物科技公司的GenExo混合試劑。

9.一種從少量血清中快速提取exosome的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權利要求8所述的試劑；優選地，所述試劑盒還包含用于進一步純化分離exosome的層析柱；更優選地，所述試劑盒還包括健康人血清exosome標準品或/對照品。

10.一種利用權利要求9所述的試劑盒從血液中提取exosome的方法，包括：

1)取1ml樣本血漿，3000×g離心15分鐘，吸取上清；

2)根據北京捷騰生物科技公司提供的GenExo exosome提取試劑盒的使用說明，將上清移入離心管中，按照1∶1的比例在上清中加入GenExo試劑，室溫下靜置反應5分鐘；

3)收集沉淀物；

4)加入100μl樣本緩沖液充分混合震蕩，然后加入層析管中，1500×g離心5分鐘，收集流出液；-80℃保存。