[發(fā)明專利]一種生物生產(chǎn)羥基酪醇的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610662962.2
• 申請日: 2016-08-10
• 公開（公告）號: CN107723306A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙廣榮;馬雅婷
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12P7/22;C12R1/19
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及產(chǎn)羥基酪醇的重組菌及構(gòu)建方法及羥基酪醇的生物生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)是一種天然多酚類化合物，化學(xué)名為3,4-二羥基苯乙醇，具有很強的抗氧化活性，主要以酯類的形式存在于橄欖的果實和枝葉中，橄欖苦苷經(jīng)水解后得到HT單體。研究表明羥基酪醇具有抗癌、抗菌、抗炎等多種生物和藥理活性，已經(jīng)受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

目前羥基酪醇的主要通過化學(xué)降解與合成的方法獲得，但是化學(xué)降解收率較低，而化學(xué)合成反應(yīng)過程復(fù)雜，收率低，且催化劑昂貴，化學(xué)試劑有毒，環(huán)境污染嚴(yán)重，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。生物法合成羥基酪醇途徑具有穩(wěn)定、安全、無污染的優(yōu)點，因此，通過使用合成生物學(xué)技術(shù)，在工程微生物中構(gòu)建全新的生物合成通路，實現(xiàn)羥基酪醇的從頭合成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種產(chǎn)羥基酪醇的重組菌。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種產(chǎn)羥基酪醇的重組菌的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供用產(chǎn)羥基酪醇的重組菌生物生產(chǎn)羥基酪醇的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

一種產(chǎn)羥基酪醇的重組菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)人工全合成帶trc啟動子的酮基脫羧酶基因kdc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成帶tac啟動子的4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶基因hpaBC，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；全合成載體骨架pBPE004，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

(2)將SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示核苷酸序列通過酶切連接方式與SEQ ID No.3所示核苷酸序列連接，篩選陽性克隆得到重組載體pKB；

(3)將重組載體pKB轉(zhuǎn)化到宿主菌SyBE-002447中，得到產(chǎn)羥基酪醇的重組菌SyBE-KB1菌株。

上述方法構(gòu)建的產(chǎn)羥基酪醇的重組菌SyBE-KB1菌株。

SyBE-KB1菌株生物生產(chǎn)羥基酪醇的方法，包括如下步驟：將重組菌SyBE-KB1接種在LB培養(yǎng)基中，35-38℃，200-250rpm，震蕩培養(yǎng)2-4h，轉(zhuǎn)接到含有葡萄糖的M9培養(yǎng)基中進行發(fā)酵生產(chǎn)羥基酪醇。

另一種產(chǎn)羥基酪醇的重組菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)人工全合成帶trc啟動子的酮基脫羧酶基因kdc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成帶tac啟動子的4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶基因hpaBC，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

(2)將SEQ ID No.1所示核苷酸序列通過λRed同源重組技術(shù)整合到大腸桿菌SyBE-002447中，得到SyBE-KDC菌株；

(3)將SEQ ID No.2所示核苷酸序列，通過λRed同源重組技術(shù)整合到大腸桿菌SyBE-KDC菌株中，得到產(chǎn)羥基酪醇的重組菌SyBE-KB2菌株。

上述方法構(gòu)建的產(chǎn)羥基酪醇的重組菌SyBE-KB2菌株。

SyBE-KB2菌株生物生產(chǎn)羥基酪醇的方法，其特征是包括如下步驟：將重組菌SyBE-KB2接種在LB培養(yǎng)基中，35-38℃，200-250rpm，震蕩培養(yǎng)2-4h，轉(zhuǎn)接到含有葡萄糖的M9培養(yǎng)基中進行發(fā)酵生產(chǎn)羥基酪醇。

本發(fā)明的優(yōu)點：

本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)羥基酪醇的重組菌，以葡萄糖為碳源，通過發(fā)酵生產(chǎn)羥基酪醇。本發(fā)明可解決羥基酪醇的來源問題，同時最大限度的降低了生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為羥基酪醇的合成路線。

圖2為羥基酪醇的HPLC驗證圖。(a)為標(biāo)準(zhǔn)品羥基酪醇(b)為重組菌SyBE-KB1的發(fā)酵液(c)為重組菌SyBE-KB2的發(fā)酵液

具體實施方式

利用畢赤酵母菌(Pichia pastoris GS115)中酮基脫羧酶基因kdc以及大腸桿菌(Escherichia coli)的4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶基因hpaBC，在工程大腸桿菌中實現(xiàn)了低成本以葡萄糖為生物質(zhì)碳源合成羥基酪醇。