[發(fā)明專利]構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610662140.4
• 申請(qǐng)日: 2016-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN106282240B
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱傳龍;王坤;李毓雯;李軍;岳明;朱甜甜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省人民醫(yī)院（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 楊文晰;孫忠浩

本發(fā)明公開一種穩(wěn)定高效表達(dá)c?met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)細(xì)胞株的構(gòu)建方法，通過構(gòu)建c?met基因慢病毒表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染到BMSCs，以獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)c?met蛋白的BMSCs細(xì)胞株；本發(fā)明獲得的BMSCs細(xì)胞株可以穩(wěn)定分泌表達(dá)c?met蛋白，蛋白表達(dá)量較高，且可穩(wěn)定傳代等，對(duì)于肝衰竭、腫瘤等疾病的研究具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，特不是一種構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法。

背景技術(shù)

c-met基因是由α鏈和β鏈組成的異源二聚體，其編碼蛋白質(zhì)是跨膜酪氨酸激酶受體(RTKS)超家族成員之一，具有自主磷酸化的活性。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)為c-met的配體，其與受體c-met特異結(jié)合后，可誘導(dǎo)c-met構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中的PTK發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮效應(yīng)。

肝衰竭是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，該病病情兇險(xiǎn)，進(jìn)展迅速，病死率高。目前，肝移植是該病最有效的治療方法，但因各方面條件的缺乏而受到限制。因此，尋找一種新的方式治療肝衰竭至關(guān)重要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種能自我復(fù)制和具有多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，且易于分離，增殖能力強(qiáng)，在適宜的信號(hào)刺激下可以向不同組織類型細(xì)胞分化，易于進(jìn)行外源性基因的轉(zhuǎn)染和其蛋白的表達(dá)。Yijing Cai等研究發(fā)現(xiàn)，移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可顯著改善肝衰竭患者肝功能，但經(jīng)移植BMSCs治療的肝衰竭患者肝功能只在短期內(nèi)均可以獲得明顯改善，但其遠(yuǎn)期生存率并無明顯改善。

造成上述原因可能是BMSCs回輸后歸巢于肝臟細(xì)胞數(shù)過少，以及其歸巢的細(xì)胞分化再生能力差。研究發(fā)現(xiàn)，HGF/c-met受體通路與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢密切相關(guān)，且影響B(tài)MSCs向類肝細(xì)胞分化及調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的再生功能；也有研究表明肝衰竭患者肝細(xì)胞再生障礙與肝細(xì)胞c-met基因表達(dá)水平下降，HGF/c-met通路受損有關(guān)。因此，建立穩(wěn)定高效表達(dá)c-met的BMSCs細(xì)胞株，對(duì)于以后研究BMSCs治療肝衰竭時(shí),c-met對(duì)BMSCs歸巢于肝臟及向肝細(xì)胞分化的影響，以及相應(yīng)機(jī)制及是否以后可作為治療肝衰竭患者的一種新的、更有效的治療方案都是十分重要的。且相比以往常見的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染解決了其轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染的外源基因不能整合到細(xì)胞基因組，轉(zhuǎn)染的基因表達(dá)時(shí)間短等缺點(diǎn)。目前尚未見到關(guān)于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs細(xì)胞株的研究和報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種可以穩(wěn)定表達(dá)c-met的BMSCs細(xì)胞株的構(gòu)建方法，用于多種腫瘤的相關(guān)機(jī)制研究，本發(fā)明是這樣獲得的：

一種構(gòu)建穩(wěn)定高效表達(dá)c-met蛋白的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株的方法，其具體步驟如下：

A)選取4周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，提取并培養(yǎng)BMSCs；

B)分別以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2為上下游引物，以c-met基因?yàn)槟０?根據(jù)NCBI提供的c-met(rat)mRNA序列NM-031517，委托上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成)，輕輕吹打混勻，置于PCR儀中擴(kuò)增目的基因c-met并測(cè)序鑒定；

PCR反應(yīng)體系：5×PS Buffer 10μl，2.5mM each的dNTP Mix 4μl，10μM的上游引物1μl，10μM的下游引物1μl，10ng/μL的模板1μl，PrimeSTAR HS DNA polymerase 0.5μl，ddH₂O補(bǔ)足至50μl；

PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)熱5min；98℃10s，55℃10s，72℃90s，共30個(gè)循環(huán)；4℃延伸；

C)利用限制性內(nèi)切酶AgeI酶切慢病毒載體GV35，配置酶切體系，用移液器輕輕吹打混勻，于37℃反應(yīng)3h，即獲得慢病毒載體GV358的酶切產(chǎn)物線性化載體DNA；